UF/DF 原理与 Una 耗材

Unagi 每一轮先在最高 60 psi 正压下把旧缓冲液滤出 Una，再补加等量新缓冲液，靠这样的超滤/透析过滤循环完成缓冲液交换。弄清这个循环，设置参数时就知道该选哪个截留分子量（MWCO），也会明白高浓度样品为什么要用稀释过滤（Dilute and Filter）模式。

先厘清两个缩写：UF 和 DF

UF/DF 是生物工艺里的常见术语，Unagi 把这两步整合在一台仪器里自动完成。

UF（Ultrafiltration，超滤）：用半透膜在压力下把溶液中的小分子（水、盐、缓冲液成分）滤过去。大分子（蛋白、病毒颗粒等）留在膜上方，于是体积减小，大分子浓度升高
DF（Diafiltration，透析过滤）：在 UF 的基础上，每轮过滤后补加等量的新缓冲液，再过滤一轮。如此反复，旧缓冲液就被逐步稀释替换掉了：大分子留下，小分子环境被置换

Unagi 同时具备两种能力：需要换液就做 DF，需要浓缩就做 UF，也可以先 DF 再 UF，连续完成。

Unagi 的实现方式：正压超滤

样品装在 Una 耗材里，Una 底部有一张再生纤维素（RC）超滤膜。仪器给 Una 施加正压（最高 60 psi）。小于膜截留分子量（MWCO）的组分（水、盐、小分子）被挤过膜排出，目标大分子被截留在 Una 内。

在过滤过程中，Una 内的轨道混合器同时运转。混合的作用是防止大分子在膜表面堆积（浓差极化，concentration polarization），保持过滤流速均匀。离心超滤管只靠离心力驱动，过滤时没有混合，更容易发生浓差极化。

每一轮过滤之后，仪器用超声波传感器测量 Una 内剩余体积。随后仪器自动从锥形管里吸取等量的新缓冲液补加回来。这样样品体积恢复，但旧缓冲液的比例下降了一截。多轮循环之后，旧缓冲液就被新缓冲液逐步替换到目标比例，这就是 DF 过程。

一个完整的交换循环

缓冲液交换模式下单次循环的完整步骤见下图：

缓冲液交换模式流程：进样 → 加压过滤 + 混合 → 测量体积 → 补加新缓冲液 → 重复循环 → 交换完成 → 可选浓缩

每一轮循环包含四步动作：

加压过滤 + 混合：加压腔体关闭，气源加压至设定值（15/30/60 psi），同时轨道混合器旋转。旧缓冲液透过膜排出
测量体积：加压停止，超声波传感器测量 Una 内剩余液面高度，换算为体积
补加缓冲液：自动移液通道从锥形管中吸取新缓冲液，加到 Una 中恢复到初始体积
判断是否达标：软件计算当前累计交换百分比，未达标则回到步骤 1 继续循环

选缓冲液交换 + 浓缩（Buffer Exchange + Concentrate）模式时，交换完成后还会额外做几轮纯过滤（不补液）。这几轮把体积减到设定的最终目标值。

大体积样品怎么处理：大体积样品浓缩模式

收获液、大体积洗脱液这类稀释样品，体积往往远超 Una 8 mL 的工作体积上限。大体积样品浓缩（Reduce Sample Volume）模式就是为此设计的。

大体积样品浓缩（Reduce Sample Volume）模式：稀释样品分装在锥形管中，分多轮回填到 Una 并过滤浓缩

最多可以处理 48 mL 稀释样品。其中 8 mL 直接装在 Una 里，另外最多 40 mL 装在缓冲液管架的锥形管中。仪器先过滤 Una 内的样品使体积减小，然后从锥形管中补入更多稀释样品，再过滤。如此反复，直到所有样品都集中到 Una 内并浓缩到目标体积。

Una：Unagi 的专用超滤杯

Una 是 Unagi 的核心耗材：一个聚丙烯外壳、底部嵌有超滤膜的一次性容器。每个 Una 的工作体积为 0.5–8 mL，出厂前经过压力测试确保密封性。

Una 的膜有两种材质。常用的是再生纤维素（Regenerated Cellulose，RC），低蛋白吸附特性有助于保持高回收率；另有聚醚砜（PES）30 kDa（901-2004 / 901-2014）和 100 kDa（901-2005 / 901-2015），样品与 PES 更相容时选用。RC 膜的截留分子量（Molecular Weight Cut-Off，MWCO）有三种规格：

MWCO / 货号（40 pack / 200 pack） / 典型适用对象

10 kDa:货号（40 pack / 200 pack） 901-2001 / 901-2011;典型适用对象大多数抗体和蛋白（MW > 30 kDa）

30 kDa:货号（40 pack / 200 pack） 901-2002 / 901-2012;典型适用对象抗体、大蛋白（MW > 90 kDa），更快的流速

100 kDa:货号（40 pack / 200 pack） 901-2003 / 901-2013;典型适用对象 AAV、LNP 等大颗粒（MW > 300 kDa）

每盒 Una 出厂都附有批号（lot number）。在软件的 Experiment Info 页面可以记录 Una lot #，方便后续追溯。Una 未拆封状态下无保质期限制，存放温度 4–25 °C。

MWCO 选择的简单原则

MWCO 代表膜能截留的最小分子量。对蛋白，经验法则是选分子量为目标蛋白的 1/3 左右的 MWCO。这样既保证蛋白不漏过，又让缓冲液小分子顺利通过。AAV、LNP 这类颗粒远大于任何一档 MWCO，不按这个比例选，直接用最大的 100 kDa。

IgG 抗体（~150 kDa）→ 用 30 kDa 或 10 kDa 的 Una
Fab 片段（~50 kDa）→ 用 10 kDa
AAV（~5,000 kDa）→ 用 100 kDa
LNP（>10,000 kDa）→ 用 100 kDa

MWCO 越大，过滤流速越快，实验时间越短。但如果目标分子大小接近 MWCO，就有样品损失的风险。遇到不确定的样品，先用小 MWCO 的 Una 跑一次，确认回收率后再考虑是否换大 MWCO 提速。

加样前必做：Una 预润湿

每个 Una 加样前都要预润湿：干燥的 RC 膜需要先被水润湿才能正常过滤。

### 预润湿步骤

- 向 Una 中加入至少 2 mL PBS、无菌去离子水或样品初始缓冲液

- 静置至少 2 分钟

- 将液体倒出：倒出，不要用移液器吸，吸取可能损坏膜

- 轻拍或摇晃去掉残留液滴

注意：只预润湿当天要用的 Una。预润湿后未使用的 Una 膜可能变干，影响性能。

其他配套耗材

除了 Una 以外，Unagi 运行还需要以下耗材，都必须符合指定规格：

耗材 / 货号 / 说明

50 mL 锥形管:货号 901-2020（500 支装）;说明放在缓冲液管架上装缓冲液。尺寸须符合 Unagi 规格，以确保机械臂定位准确；尺寸合适的任何品牌都可用

1 mL 吸头:货号 901-2031（100 rack，9600 支）;说明一次性移液吸头，须为指定规格，但不必从 Unchained Labs 采购。开启吸头复用（Reuse Tips）后每组吸头可重复使用最多 12 次

重要：Unagi 的液体处理系统针对配套耗材的尺寸进行了标定。使用不符合指定规格的耗材可能导致机械碰撞或样品溢出。

### 下一步

→ 从打开软件到开始运行

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