Leprechaun · 外泌体与慢病毒单颗粒表征

• apps · 两类样品
• how · 工作原理
• lenti · 慢病毒
• ev · 外泌体
• compare · 常规方法
• workflow · 芯片与流程
• spec · 规格
• next · 下一步
• 申请演示
• 耗材清单
• 粒径下限 · 35 · nm
• 荧光通道 · 3 · 色
• 样品量 · 1–25 · µL
• 通量 · ≤16 · 片 / 批
• 粒径 · SP-IRIS 干涉成像，35–200 nm
• 表型 · 3 色荧光，加捕获抗体，每颗最多 4 个标志物
• 慢病毒收获液中 4 种亚型和聚集体的颗粒浓度柱状图 · 慢病毒 · 完整病毒、空衣壳、聚集体，分开计数
• GFP 阳性与阴性两群 EV 的粒径分布曲线 · 外泌体 / EV · 35–50 nm 的小囊泡也测得到
• 图 · 一支收获液：完整病毒约 2×10⁹ /mL，空衣壳约 1×10⁹ /mL
• 其余 · 无衣壳颗粒、聚集体，从不到 1×10⁸ 到约 6×10⁸ /mL 不等
• 样品 · 收获液稀释即可上样
• 图 · GFP⁻ 在约 42 nm 一个尖峰；GFP⁺ 更宽，双峰约 65 / 85 nm
• 样品 · 培养上清离心去碎片即可；血浆、血清先过 SEC 柱
• 非 VSV-G 假型
• 常规方法 · p24 ELISA、qRT-PCR、转导各测一项，分不开这几类
• p24 衣壳
• 完整病毒 · ✓ · ✓ · ✓
• 有壳无 RNA（空衣壳） · ✓ · ✓ · —
• 无壳有 RNA · ✓ · — · ✓
• 无壳无 RNA · ✓ · — · —
• 聚集体 · — · —
• 完整病毒
• 有壳无 RNA（空衣壳）
• 无壳有 RNA
• 无壳无 RNA
• 无壳有 RNA · 粗样品中多见，可能是含 RNA 的囊泡
• 用处 · 粗样品阶段就挑出值得纯化的批次
• 前代 · NanoView ExoView R100 / R200（2022 年并入 Unchained Labs）
• 升级 · 光学系统和背景扣除算法；下限 50 nm（ExoView R200）→ 35 nm
• 同一份 EV 标准品 · GFP⁻ 囊泡 61% 小于 50 nm，在 ExoView 范围之外
• 默认标记
• Blue · 470 nm · CD9 · 广泛分布于多种 EV 亚群
• Green · 567 nm · CD81 · 多数 EV 亚群都带
• Red · 623 nm · CD63 · 外泌体经典标志物，富集于 MVB 来源小囊泡
• 广泛分布于多种 EV 亚群
• 多数 EV 亚群都带
• 外泌体经典标志物，富集于 MVB 来源小囊泡
• 自选抗体
• 只要总数
• 共同的缺口 · 只说颗粒有多少，说不清颗粒是什么
• Leprechaun · 抗体捕获定类别，干涉测径，荧光分型
• 漏掉什么
• p24 ELISA · p24 蛋白总量 · 游离 p24 也被计入
• qRT-PCR · 核酸拷贝数 · 有 RNA 不等于颗粒完整
• 细胞转导 · 感染性颗粒 · 要培养数天；漏掉完整但不感染的
• NTA · 布朗运动计数 · 脂蛋白、蛋白聚集体一起计数；50 nm 以下难测
• 纳米流式 · 散射 + 荧光 · 要先纯化，可能丢稀有亚群；多数难测 50 nm 以下
• TRPS · 电阻脉冲计数 · 没有表型；50 nm 以下难测
• p24 蛋白总量
• 游离 p24 也被计入
• 核酸拷贝数
• 有 RNA 不等于颗粒完整
• 细胞转导
• 感染性颗粒
• 要培养数天；漏掉完整但不感染的
• 布朗运动计数
• 脂蛋白、蛋白聚集体一起计数；50 nm 以下难测
• 纳米流式
• 散射 + 荧光
• 要先纯化，可能丢稀有亚群；多数难测 50 nm 以下
• 电阻脉冲计数
• 没有表型；50 nm 以下难测
• 手动 · 上样、按提示加荧光抗体、把 Luni 装进支架
• Luni Washer · 清洗、换水、干燥，一次最多 24 片
• 仪器 · 背景扫描、样品扫描、分析，单批最多 16 片
• Lentivirus Luni · anti-VSVG（两行）、anti-p24（测游离 p24）、Isotype
• Exosome Tetraspanin Luni · CD9、CD81、CD63、Isotype
• 每盒 Kit（以 Exosome Kit 为例） · 8 片 Luni、25 µL 荧光抗体、2 张封板膜、1 个 USB
• Lentivirus Luni
• anti-VSVG（两行）、anti-p24（测游离 p24）、Isotype
• Exosome Tetraspanin Luni
• CD9、CD81、CD63、Isotype
• 每盒 Kit（以 Exosome Kit 为例）
• 8 片 Luni、25 µL 荧光抗体、2 张封板膜、1 个 USB
• 另含 · 孵育液（10X）、封闭液
• EV 孵育 · 室温 16 h；EV 丰富时 1 h
• 慢病毒孵育 · 在 Luni 上 1 h
• 测 RNA · 先与染料 37 °C 孵育 16 h
• EV 孵育
• 室温 16 h；EV 丰富时 1 h
• 慢病毒孵育
• 在 Luni 上 1 h
• 测 RNA
• 先与染料 37 °C 孵育 16 h
• 电脑 · Windows 11 独立计算机
• 认证 · CE、TÜV
• SP-IRIS 光源 · 415 nm LED
• 粒径范围 · 35–200 nm
• 粒径精度 · ≤5%
• 荧光 LED（B / G / R） · 470 / 567 / 623 nm
• 激发波段（B / G / R） · 465–495 / 543–568 / 625–655 nm
• 荧光强度精度 · ≤5%
• 检测器 · 科研级制冷 CMOS
• SP-IRIS 光源
• 粒径范围
• 粒径精度
• 荧光 LED（B / G / R）
• 470 / 567 / 623 nm
• 激发波段（B / G / R）
• 465–495 / 543–568 / 625–655 nm
• 荧光强度精度
• 科研级制冷 CMOS
• 检测下限 · 慢病毒 · 1×10⁷ vp/mL
• 检测下限 · EV 孵育 1 h · 5×10⁶ /mL
• 检测下限 · EV 孵育 16 h · 5×10⁵ /mL
• 样品用量 · 1–25 µL
• 单批通量 · 1–16 片 Luni
• 尺寸 · 23.4 × 47.8 × 35.2 cm
• 重量 · 20.5 kg
• 电源 · 100–240 V AC，50–60 Hz
• 检测下限 · 慢病毒
• 检测下限 · EV 孵育 1 h
• 检测下限 · EV 孵育 16 h
• 样品用量
• 单批通量
• 1–16 片 Luni
• 23.4 × 47.8 × 35.2 cm
• 100–240 V AC，50–60 Hz
• 收获液里完整颗粒占多少，和 qRT-PCR 对得上吗？ · 慢病毒应用笔记
• 换了非 VSV-G 包膜，怎么测假型滴度？ · Flex 应用笔记
• SYTO14 染色和上样，两天怎么排？ · 慢病毒 RNA 流程
• 慢病毒样品里混了多少 EV？ · EV 污染物流程
• 35–50 nm 的小囊泡占多少？ · EV 应用笔记
• 上清、血浆、尿液上样前怎么处理？ · 外泌体流程
• 自选荧光抗体该放哪个通道？ · 荧光通道
• 外泌体与慢病毒 · 单颗粒表征
• 35 nm 起，逐颗读出粒径与表型
• 芯片上的抗体先抓住目标颗粒，再逐颗测粒径、计数、分型。
• 粒径SP-IRIS 干涉成像，35–200 nm表型3 色荧光，加捕获抗体，每颗最多 4 个标志物
• 慢病毒和 EV，按亚型分开计数
• 想深入SP-IRIS 与 35 nm →捕获、染色、干燥 →软件怎么分亚群 →
• 样品加到 Luni 之后，发生了什么
• 非 VSV-G 假型Flex RNA Luni 自定义捕获抗体。Flex 应用笔记 →常规方法p24 ELISA、qRT-PCR、转导各测一项，分不开这几类
• 同一个颗粒上，读包膜、衣壳和 RNA
• 按粒径和两种信号的组合，归入 4 种亚型或聚集体。
• 三个批次完整病毒占比柱状图
• 图 1同一工艺三个批次的完整病毒占比：Batch 1 约 78%，Batch 2、3 约 10–14%
• 前代NanoView ExoView R100 / R200（2022 年并入 Unchained Labs）升级光学系统和背景扣除算法；下限 50 nm（ExoView R200）→ 35 nm同一份 EV 标准品GFP⁻ 囊泡 61% 小于 50 nm，在 ExoView 范围之外
• 计数之外，读出表面标志物
• 单阳、双阳、三阳，按 CD9 / CD81 / CD63 组合分群。
• Total EVs 与 CD9、CD63、CD81 阳性 EV 浓度柱状图
• 图 2a总 EV 约 1×10⁷ /mL；CD81⁺、CD63⁺ 明显多于 CD9⁺
• 一个捕获斑点的免疫荧光实拍视野，彩色亮点为单个颗粒
• 图 2b一个捕获斑点（约 200 µm）的荧光实拍：每个亮点一个颗粒，颜色对应标志物
• 共同的缺口只说颗粒有多少，说不清颗粒是什么Leprechaun抗体捕获定类别，干涉测径，荧光分型
• 常规方法各漏掉了什么
• 手动上样、按提示加荧光抗体、把 Luni 装进支架Luni Washer清洗、换水、干燥，一次最多 24 片仪器背景扫描、样品扫描、分析，单批最多 16 片
• 一片 Luni 一个样品，手动只剩上样和加抗体
• 每个斑点约 200 µm，每种抗体至少三重复，另有同型对照。
• Leprechaun Analysis 软件界面：样品亚群组成、粒径分布与逐 Luni 数据表
• 图 3Leprechaun Analysis：左为亚群组成（Sample Composition），右为各亚群粒径分布（35–200 nm），下为逐片 Luni 的各亚群浓度与完整病毒占比
• 电脑Windows 11 独立计算机认证CE、TÜV
• 按手上的问题读下一篇

• CD9
• CD81
• CD63
• Isotype

Luni 芯片 · 每种抗体一行斑点（示意）

SiO₂ / Si 芯片anti-CD81 捕获斑点50 µL含样品 1–25 µL，用孵育液稀释加样前，Luni 先做一次背景扫描抗体抓住带 CD81 的囊泡0个已捕获碰到抗体 → 被抓住，不再动不带 CD81 的囊泡 → 不结合脂蛋白、蛋白聚集体 → 基本不结合，清洗时冲走室温静置孵育 16 hEV 丰富时 1 h · 动画已压缩时间Luni Washer 清洗 · 染色 · 干燥一次最多 24 片虚线 = 左图截面一个亮点= 一个颗粒表面反射光与颗粒散射光干涉，信号放大35–200 nm逐颗计数伪彩 · 同一位置叠出几种颜色，就检出几种标志物＋ 捕获抗体本身亮度 → 粒径按校准曲线换算 · 曲线形状示意

粒径（nm）信号一份报告同一个颗粒 · 同一次扫描- 颗粒数 → 浓度 — 总数取自干涉通道

• 粒径分布 — 35–200 nm，逐颗
• 表型 · 共定位 — 加上捕获抗体，最多 4 个标志物
• 同型对照 — 定荧光截止值，排除非特异信号

• 抗体抓住颗粒
• 洗 · 染 · 干燥
• SP-IRIS 干涉成像
• 越亮，颗粒越大
• 三色荧光分型
• CD9 · Blue · CF488A
• CD81 · Green · CF555
• CD63 · Red · CF647
• wash · 清洗 · 冲走没被抓住的颗粒
• stain · 荧光抗体染色 · 按提示手动加荧光抗体，标记表面标志物
• dry · 干燥 · 芯片干透才能上机
• 颗粒数 → 浓度 · 总数取自干涉通道
• 粒径分布 · 35–200 nm，逐颗
• 表型 · 共定位 · 加上捕获抗体，最多 4 个标志物
• 同型对照 · 定荧光截止值，排除非特异信号
• 271,-12 289,-12 282,78 278,78
• 仪器读数示意