Unagi 缓冲液置换与浓缩:三个实验回收率不低于 95.5%

Unagi 缓冲液置换与浓缩:三个实验回收率不低于 95.5%

用 human IgG 做了三个实验:4 mL 只换缓冲液,8 mL 换完再浓缩 8 倍,48 mL 稀释样品浓缩到 8 mL,回收率都不低于 95.5%。Unagi 用压力驱动的超滤/透析过滤(UF/DF)自动完成整个过程,超声体积监测实时测出每次循环去除和保留的体积,置换百分比和浓缩倍数据此控制。

Unagi:自动化台式缓冲液置换和浓缩平台,同时处理最多 8 个样品。

压力驱动 UF/DF,每一步都知道剩了多少

Unagi 的一次性耗材叫 Una,采用 10 kDa 再生纤维素膜,耐压 60 psi,工作体积 0.5–8 mL。运行时 Unagi 交替进行加压过滤(配合轻柔混合防止膜面堆积)、超声体积测量和新缓冲液补充。超声传感器测出每次循环去除和保留的体积,实验 1 的终体积是 4.04 ± 0.03 mL。软件根据实际去除量自动调整加压时间,来逼近用户设定的每循环去除百分比。

实时反馈带来两个好处。置换百分比按实际去除量计算,不会因为样品粘度不同而置换不足或过度;浓缩停在设定体积,不会过头,也就避免了急剧的配方变化引发聚集。所以,低浓度蛋白或相似缓冲液之间的置换可以用高去除百分比加速;高浓度蛋白或容易聚集的样品可以用低去除百分比保守操作,时间长一点但保证回收。

Unagi UF/DF 流程:输入样品 → 加压过滤 + 混合 → 超声测体积 → 补充新缓冲液 → 重复 → 置换完成 → 可选浓缩。

A. Una 一次性耗材(10 kDa 再生纤维素膜)。B. 样品架装 1–8 个 Una,锁入 Unagi 置换舱。

Reduce Sample Volume 应用:板上 Falcon 管装最多 48 mL 样品,填入 Una 后加压浓缩到 8 mL。再跑一次 Concentrate Only 可进一步缩到 0.5 mL(最高 96 倍浓缩)。

实验条件(通用)

样品:Human IgG(hIgG),PBS pH 6.8;各实验的起始浓度见对应小节。

耗材:10 kDa Una。

目标缓冲液:PBS pH 6.8。

置换参数:总目标置换 96%,每循环去除 66%。

浓度检测:Lunatic A280(E1% 按 hIgG 设定)。

实验 1:只换缓冲液,浓度和体积不变

hIgG 原液,4 mL/Una × 8 个 Una。目标 96% 置换,不浓缩。3 个循环、每循环约 20 分钟完成。8 个样品总运行时间 2.3 小时,长于循环时间之和。

指标 / 起始 / 目标 / 实测

浓度 (mg/mL):起始 52.3;目标 52.3;实测 53.4 ± 1.0

体积 (mL):起始 4.0;目标 4.0;实测 4.04 ± 0.03

% exchanged:起始 —;目标 >96;实测 96.5 ± 0.5

% recovery:起始 —;目标 —;实测 96.2 ± 0.5

实验 2:换完缓冲液再浓缩 8 倍

hIgG 9.9 mg/mL,8 mL/Una。先做缓冲液置换(96% 目标,4 个循环 × 约 16 分钟,实测 97.5%),再做 8 倍浓缩(1 个浓缩循环,约 1 分钟),目标终浓度 79.2 mg/mL。8 个样品总耗时 3.3 小时。

指标 / 起始 / 目标 / 实测

浓度 (mg/mL):起始 9.9;目标 79.2;实测 79.3 ± 1.6

体积 (µL):起始 8,000;目标 1,000;实测 989.3 ± 10.8

% exchanged:起始 —;目标 >96;实测 97.5 ± 0.2

% recovery:起始 —;目标 —;实测 96.7 ± 0.7

实验 3:48 mL 稀释样品浓缩 6 倍

hIgG 0.25 mg/mL,每个 Una 装 8 mL + Falcon 管装 40 mL(共 48 mL)。用 Reduce Sample Volume 应用浓缩到 8 mL,目标 6 倍浓缩(1.47 mg/mL)。样品分多轮过滤,逐步集中到 Una 内,不换液。实测浓度略低于目标,差的部分与 95.5% 的回收率对得上。

指标 / 起始 / 目标 / 实测

浓度 (mg/mL):起始 0.25;目标 1.47;实测 1.4 ± 0.01

体积 (mL):起始 48;目标 8;实测 8.15 ± 0.02

% recovery:起始 —;目标 —;实测 95.5 ± 0.4

从 4 mL 到 48 mL,三个实验的回收率均不低于 95.5%

三个实验覆盖了缓冲液置换的典型场景:只换不浓缩(回收率 96.2%)、换完再浓缩 8 倍(回收率 96.7%)、大体积稀释样品浓缩(回收率 95.5%)。8 个 Una 之间,置换百分比的标准差最大只有 0.5。这意味着同一板上 8 个样品的置换程度基本一致,后续分析数据可以直接并排比较。