【Webinar】去垢剂裂解不开的纳米载体怎么测包封率：黏膜疫苗的三个表征难题与 Stunner AF

关于本次 Webinar

黏膜疫苗免针，还能在黏膜表面诱导分泌型 IgA。它离不开专门设计的纳米载体：聚合物、脂质、多糖或杂化纳米粒。这类颗粒溶液有浊度，组分复杂，常规的染料法和蛋白定量试剂盒可能测不准。

Unchained Labs 的 Kevin Lance 先介绍 Stunner AF：每孔 2 µL，同一份样品可做 UV-Vis、DLS 和荧光三种检测。UV-Vis 自动扣除浊度、拆出载荷吸收，荧光测游离载荷，两者合起来不裂解颗粒就能算包封率。

法国国家科学研究中心（CNRS）的 Claire Monge 接着讲 Nanovec 课题组遇到的三个难题。聚合物-脂质杂化纳米粒用去垢剂裂解不完全，改用 Stunner 后包封率结果高度重复。表面吸附卵清蛋白的颗粒，游离脂质干扰常规试剂盒，改用 UV-Vis 和荧光模式测出吸附效率。工程化病毒样颗粒（eVLP）样品出现两个峰，用质量分布挑出主峰，再比较两种细胞培养条件下的蛋白含量。最后约 8 分钟是问答，涉及测量时间、DLS 测量范围、可测的偶联物类型和样品类型。

站内另一场 Stunner AF webinar 专讲 LNP： 不用表面活性剂测 LNP 包封率和粒径。

### 你将了解到

• 00:00:00 · 00:01:14 · 开场与讲者介绍 · Vaccine Insights 主持人 Will 介绍两位讲者。Kevin Lance 是 Unchained Labs 产品管理总监，负责全球 Stunner 产品线。Claire Monge 是法国国家科学研究中心（CNRS）研究员，带领 Nanovec 课题组研究黏膜给药的纳米载体。
• 00:01:14 · 00:01:56 · 纳米颗粒样品的浊度难题 · 无论 LNP、杂化纳米粒还是新一代纳米载体，溶液都有浊度，会干扰常规 UV-Vis，测包封率、总浓度甚至粒径时都得把它考虑进去。
• 00:01:56 · 00:02:55 · Stunner AF：2 µL，三种检测技术 · 微流控耗材每孔只要 2 µL，同一份样品用三种技术读。UV-Vis 测总浓度，针对大颗粒设计的 DLS 测粒径，荧光测游离核酸或复杂溶液。
• 00:02:55 · 00:03:42 · 上样演示：样品留在微流控回路里 · 2 µL 荧光素溶液滴入 Stunner 板后靠毛细作用进入微流控回路。读板后样品全部留在耗材里，DLS、UV-Vis 和荧光都在中间两个菱形微型比色池里读。
• 00:03:42 · 00:04:31 · UV-Vis 测蛋白：短光程穿过浊度 · IgG 稀释系列 8 次重复，覆盖很宽的浓度范围，只做 UV-Vis 时整板约 10 分钟。光程极短且经过精确标定，有浊度的样品也能测。
• 00:04:31 · 00:05:48 · 纳米颗粒的 UV-Vis：扣掉浊度，拆出载荷 · Stunner 自动扣除浊度曲线，拆出 RNA 载荷和颗粒本身（主要是胆固醇）的吸收，不需要任何前处理就能得到总载荷。96 个纳米颗粒样品 CV 为 1.54%；同时含 RNA 和蛋白的 LNP 也能分别定量。
• 00:05:48 · 00:06:23 · 荧光定量 RNA · Stunner AF 用蓝色 LED 激发 RNA 荧光染料，先读标准曲线，再按标准曲线给未知样品定量。
• 00:06:23 · 00:07:23 · 包封率：不用去垢剂裂解颗粒 · 常规方法要用去垢剂裂解纳米颗粒才能测总 RNA。Stunner AF 用荧光染料测游离 RNA，用 UV-Vis 直接测总载荷，两个结果合起来就是包封率。
• 00:07:23 · 00:08:31 · DLS 粒径：单角度或多角度 · 一个 DLS 检测器可以固定在单一角度，也可以选配转到多个角度，给出强度、质量和数量分布。粒径、浓度、总载荷、游离载荷和包封率在一块板、一次读板里完成。
• 00:08:31 · 00:10:11 · 黏膜组织：表面积大，持续在做免疫决策 · Claire 介绍：黏膜总面积约 400 平方米，持续接触微生物；免疫决策在黏膜相关淋巴组织（MALT）里作出。
• 00:10:11 · 00:11:50 · 为什么要做黏膜疫苗 · 黏膜疫苗免针，依从性更好。注射疫苗几乎只诱导循环中的 IgG；黏膜疫苗诱导分泌型 IgA 和驻留 B、T 细胞，有助于防感染、降低传播风险。口服适合肠道病原，鼻内和舌下适合呼吸道和性传播病原。
• 00:11:50 · 00:12:56 · 黏膜疫苗为什么难设计 · 已上市的黏膜疫苗多为口服；注射疫苗不能直接装进喷雾里用。黏液、黏液纤毛清除、pH、酶和免疫耐受都要考虑，纳米载体和给药装置也要专门设计。
• 00:12:56 · 00:13:56 · Nanovec 的纳米载体工具箱 · 聚合物、脂质、多糖和杂化纳米粒，载荷从蛋白、多肽到核酸。三条策略：舌下给药用黏膜黏附膜，用泊洛沙姆等表面活性剂穿过黏液层，提高杂化颗粒刚性以耐受雾化。
• 00:13:56 · 00:15:01 · 三个表征难题 · 一是杂化纳米粒 mRNA 疫苗的包封率；二是蛋白抗原亚单位疫苗的吸附效率；三是工程化病毒样颗粒（eVLP）的表征和蛋白含量。
• 00:15:01 · 00:16:44 · 难题一：常规染料法测包封率不重复 · 常规方法用去垢剂裂解颗粒、加 RNA 荧光染料、上酶标仪。聚合物-脂质杂化纳米粒两批之间 DLS 结果高度重复，包封率却完全不重复，且与细胞实验不符。释放实验显示，去垢剂没能把颗粒完全裂解。
• 00:16:44 · 00:17:48 · 改用 Stunner：不裂解，结果重复 · 不加去垢剂、不用孵育，样品直接上 Stunner 板：UV-Vis 测总 mRNA，荧光测游离 mRNA。结果变得高度重复，也避开了染料和颗粒成分之间的干扰。
• 00:17:48 · 00:19:14 · 难题二：蛋白吸附在颗粒表面，试剂盒用不了 · 聚合物核、脂质冠的纳米颗粒表面吸附蛋白抗原，用于鼻内疫苗。常规做法是用 Bradford、BCA 或 CBQCA 测上清蛋白，但游离脂质会和试剂发生非特异性相互作用。
• 00:19:14 · 00:20:55 · UV-Vis 和荧光测吸附效率 · 用 Stunner 的 UV-Vis 模式测模型蛋白卵清蛋白（OVA），上清中含量极低，吸附效率约 100%。混入荧光 OVA 后用荧光模式测，游离部分约 10%，吸附效率约 90%；两种模式合起来能分清各组分比例，便于控制给药剂量。
• 00:20:55 · 00:22:34 · 难题三：eVLP 的粒径分布 · 两种构建体分别让 HIV 糖蛋白在膜上表达，或随 eVLP 分泌出来并在表面多聚化。转染后取上清，用纳米颗粒程序同板读出各样品的强度和质量分布。质量分布显示峰 1 是主体，约 500 亿个/mL，峰 2 只有约 600 万个/mL。
• 00:22:34 · 00:23:44 · 比较培养条件下的蛋白含量 · 用蛋白程序比较各样品的蛋白浓度，结合峰 1 的水合直径，比较悬浮细胞和贴壁细胞两种转染条件：悬浮培养得到的 eVLP 蛋白更多。
• 00:23:44 · 00:24:27 · Q&A：测一板要多久 · UV-Vis 加 DLS 每个样品约 45 秒，整板约 1 小时；只做 UV-Vis 约 10 分钟。
• 00:24:27 · 00:24:59 · Q&A：DLS 能测多大的颗粒 · 直径 0.3–1000 nm，覆盖疫苗领域常见对象：约 10 nm 的蛋白、30–40 nm 的小病毒、100 nm 左右的纳米颗粒。
• 00:24:59 · 00:25:32 · Q&A：聚合物吸收会不会干扰蛋白光谱 · 聚合物和蛋白的吸收接近，但细微差别足以靠解卷积把两者分开。
• 00:25:32 · 00:26:14 · Q&A：表面吸附的 mRNA · Claire 解释 RNA 荧光染料对颗粒表面吸附 mRNA 的响应，以及能否靠吸收差异区分它和游离 mRNA。
• 00:26:14 · 00:27:15 · Q&A：哪些偶联物能测 · 单组分或双组分纳米颗粒都可以：RNA 载荷 LNP、含 RNA 和蛋白的 LNP、以蛋白为骨架装载核酸的杂化颗粒。抗体-寡核苷酸偶联物和 ADC 也能测，只要一个组分是蛋白、另一个不是。
• 00:27:15 · 00:27:50 · Q&A：血浆和鼻拭子样品 · 测核酸、蛋白浓度或颗粒浓度都在 Stunner 的能力范围内，讲者团队测过这类样品。
• 00:27:50 · 00:28:41 · Q&A：佐剂放在哪，NP 还是 VLP 更好 · 疏水佐剂包封在聚合物核内，蛋白吸附在脂质冠上。纳米颗粒和病毒样颗粒哪个免疫效果好，取决于抗原，难以一概而论。
• 00:28:41 · 00:29:18 · Q&A：和其他方法比对过吗 · Claire 团队购买前做过大量比对，结果相当；他们看重的是一台设备能做几类分析。
• 00:29:18 · 00:30:05 · Q&A：蛋白怎样结合到杂化纳米粒表面 · 先用纳米沉淀法做聚合物核，再加聚合物或脂质冠，最后让蛋白吸附到表面。第一类杂化颗粒则全程用微流控制备，mRNA 包在内部，和经典 LNP 类似。
• 00:30:05 · 00:30:35 · Q&A：Stunner AF 测哪几类参数 · UV-Vis 测总载荷浓度，荧光测游离载荷浓度，DLS 测粒径，都只需很小的样品量。
• 00:30:35 · 00:31:28 · Q&A：传统 LNP 同样适用 · 和 Claire 今天展示的一样，Stunner AF 测杂化纳米粒和传统 RNA LNP 效果相同。
• 了解浊度为什么会干扰纳米颗粒的 UV-Vis 测量，Stunner AF 怎样扣除它
• 看懂不裂解颗粒测包封率的思路：UV-Vis 测总载荷，荧光测游离载荷
• 学会用 UV-Vis 和荧光两种模式测蛋白抗原在纳米颗粒表面的吸附效率
• 理解怎样用质量分布从多峰的 eVLP 样品里挑出主峰再做比较