三家机构发表的 AAV 评估数据,以及它们给出的样品准入条件

三家机构发表的 AAV 评估数据, 以及它们给出的样品准入条件

AAV Quant 把紫外-可见吸收、静态光散射(SLS)和动态光散射(DLS)放进同一次 2 µL 测量。三篇同行评议论文把它与 ddPCR、qPCR、ELISA、银染、冷冻电镜和分析超速离心对照,样品覆盖多种血清型、基因组长度和纯化工艺。本文整理三篇的测量条件、对照结果,以及论文给出的样品准入判据:什么样的样品能用它定量,什么样的样品先要处理。

三篇论文的作者单位与样品规模

下面三篇均为开放获取,正文写明使用 Stunner 的 AAV Quant 应用。三篇的空白都用水。Liu 等与 Yang 等在方法中写明同一个理由:用水做空白,是为了避免缓冲液空白在紫外解卷积中过度扣除。Li 等也写明用水做空白、DLS 用默认的 4 × 5 秒设置。

  • Liu 等,2024,Molecular Therapy: Methods & Clinical Development:Children’s Hospital of Philadelphia,合著者含 Unchained Labs 员工。150 个纯化 rAAV 对照 ddPCR 和银染,60 个对照 qPCR,另有冷冻电镜、预混空满样品和两条纯化工艺的中间样品。
  • Yang 等,2022,GEN Biotechnology:Vigene Biosciences(Charles River 旗下),合著者含 Unchained Labs 员工。四种血清型的六个构建体对照 qPCR 和 ELISA,一个 AAV5 样品另做透射电镜和分析超速离心,文末给出样品准入判据。
  • Li 等,2026,Pharmaceutics:Regeneron。高通量自动化配方平台,128 个 AAV1 配方;稳定性读数用 Stunner,与 ddPCR 和单样品 DLS 对照。

三篇的条目与其余 Stunner 论文一并收在《Stunner 用户发表文献》。AAV Quant 本身的测量原理见《2 µL、一分钟:AAV 衣壳滴度、空满比和聚集一次测出》。

纯化样品的滴度与 ddPCR 的相关系数为 0.91

Liu 等用 150 个纯化 rAAV 样品比较满衣壳滴度与 ddPCR 基因组滴度,Pearson 相关系数 r = 0.91,p < 0.001,回归 R² = 0.83。样品含 108 个独立载体,标准血清型占 66%、工程化衣壳占 34%。与 qPCR 的比较用 60 个样品,r = 0.82,R² = 0.67。总衣壳滴度与 SDS-PAGE 银染颗粒滴度的比较用 150 个样品,r = 0.84,R² = 0.71。

同一篇把样品量缩小后重算:每组随机抽取六分之一、重复 10,000 次,ddPCR 组相关系数中位数 0.91(95% 置信区间 0.81–0.96),银染组 0.85(0.64–0.93),qPCR 组 0.83(0.53–0.94)。

按衣壳来源分组时,常规血清型组的相关系数为 0.86,工程化衣壳组为 0.75,两组差异不显著(p = 0.078)。作者的解释是工程化衣壳的氨基酸序列未公开,分析时的消光系数为估算值。

Yang 等的口径以偏差表述:qPCR 滴度高于 5E12 vg/mL 时,满衣壳滴度与 qPCR 结果相差在 30% 以内;总衣壳滴度与 ELISA 相差通常也在 30% 以内。重复性方面,满衣壳组在至少 20% 满的样品中变异系数为 0.4%–6.5%,qPCR 为 2.9%–5.6%;总衣壳组变异系数 0.4%–4.4%,ELISA 为 0.4%–5.9%。

两篇都指出同一点:这套方法不依赖标准曲线、引物或血清型特异抗体,一块板上可以混测不同血清型,96 个样品约 1 小时。

空满比与冷冻电镜无显著差异,预混比例能测回来

Liu 等取两个纯化载体和它们的 1:1 混合物,分别用冷冻电镜和 Stunner 测 % full,三个样品的差异均不显著。再把已知的满衣壳按 100/0、80/20、60/40、40/60、20/80、0/100 与空衣壳混合,实测 % full 对预混比例的回归为 y = 0.9699x,R² = 0.9944,p < 0.001,斜率的 95% 置信区间为 0.903–1.036。

Yang 等的五个构建体中,% full 与 qPCR/ELISA 推算值相差在 15% 以内。同一篇也把一个 AAV5 样品用四种方法各测一次:Stunner 33%、qPCR/ELISA 23%、透射电镜 55%、分析超速离心 72%。作者据此说明,不同正交方法给出的 % full 本身差别很大,数据量有限时无法判定哪个是真值。换方法比较 % full,要先确认两种方法的口径。

Liu 等另指出一条边界:该方法不报告部分包装的衣壳。要评估基因组完整性或截短基因组,论文建议另配多重 PCR、毛细管电泳等方法。

残留碘克沙醇在 246 nm 吸收,会把样品读成全满

碘克沙醇(iodixanol)密度梯度超速离心是常用的纯化方式,残留的碘克沙醇在紫外区有吸收,峰位约 246 nm,落在核酸和蛋白的读数区间内。

Yang 等测了一支经碘克沙醇密度梯度离心、再换液到 PBS 的 AAV9,A260/A280 为 1.75。按传统读法,这个比值会被理解为 DNA 过量。解卷积把光谱拆开后可以看到,抬高比值的是残留碘克沙醇,不是多余的 DNA;同一次分析把碘克沙醇单独定量为 0.0088%。

同一篇的稀释系列里也能看到后果:16 倍和 32 倍稀释的样品都被报为 100% full,原因是残留碘克沙醇干扰了 ssDNA 的解卷积;稀释 8 倍以内的样品 % full 落在 36%–47%。作者写明,多技术联用降低了碘克沙醇这类共吸收杂质的影响,但没有消除。Liu 等的说法一致:该平台可以耐受盐、表面活性剂和常见缓冲液,碘克沙醇除外。

处理路径是先把碘克沙醇降下来再测,例如换液或透析后再上机,并在结果中核对杂质组分的占比。换液方案见《LNP 去乙醇回收 98%,AAV 换液空满比基本不变》。

Figure 1. 引自 Yang 等 2022 Figure 6。A:1E14 vg/mL AAV9 经碘克沙醇密度梯度离心并换液到 PBS 后的吸收光谱,下方表给出 A260/A280 = 1.75、A260 = 10.39 OD、A280 = 5.96 OD。B:同一条光谱的解卷积结果,黑为总光谱、绿为 DNA、蓝为蛋白、紫为杂质(含碘克沙醇),紫色曲线在 250 nm 附近有峰;下方表给出 ssDNA 1.01E14 vg/mL equiv.、蛋白 1.45E14 cp/mL equiv.、碘克沙醇 0.0088%。

四条判据决定一个样品能不能用于定量

Stunner 的滴度是绝对定量,不走标准曲线,所以标准曲线那套验收标准不适用。Yang 等改为按单个样品的物理量给判据:四条阈值取自变异系数超过 20% 的那些稀释点,四项都能在 AAV Quant 的结果里直接读到。

样品指标 / 判据 / 理由

A280:判据 > 0.1 OD;理由 衣壳的吸收要足够高才能检出

杂质 A230 占总 A230 的比例:判据 < 0.5;理由 样品要足够纯,解卷积才准

Derived intensity:判据 > 100,000 cps;理由 DLS / SLS 检测器需要足够的信号

Capsid intensity:判据 > 85%;理由 散射信号要主要来自完整衣壳

Table 1. 引自 Yang 等 2022 Table 1,译自原表三栏。

同一篇给出的检出下限为满衣壳滴度 1E12 vg/mL、总衣壳滴度 2E12 cp/mL,并说明线性范围随载体的 ITR 间基因组长度和纯化方式而变,建议各实验室用自己的参考品标定一次。Liu 等的工作范围写作 10¹² 低段到 10¹³ 中段 vg/mL。Yang 等另写明样品应足够纯,并以银染 SDS-PAGE 的病毒条带占 99% 为例;宿主细胞残留的核酸和蛋白会抬高背景,因为紫外读数对 AAV 没有特异性。

某一项不达标时,论文的处理路径是改用定性判读:PDI 大于 0.2 提示样品中同时存在衣壳和大聚集体,紫外解卷积可用于判断样品里 DNA 是否过量。有一项或多项不达标,说明这个样品需要进一步处理。

粒径的灵敏度与定量不同步。Yang 等的一支 AAV8(qPCR 滴度 8.0 × 10¹¹ vg/mL)在两倍和四倍稀释后仍测得稳定的衣壳直径(27.9–28.8 nm),而这个浓度已低于定量下限。

工艺中间样品:论文把它用作定性比较

Liu 等取氯化铯密度梯度纯化的四个工序点(粗收获液、浓缩、第一次氯化铯、第二次氯化铯)各测一次。杂质在粗收获液中很高,浓缩后进一步升高,两次氯化铯梯度后大幅下降。蛋白在第一次氯化铯后降低约 30 倍,DNA 降低约 4 倍;% full 从粗收获液和浓缩样品的 35% 升到第一次氯化铯后的 90%,第二次后接近 100%。

亲和层析的两份样品对照明显:流穿液的吸收高,含大量游离和聚集的蛋白与 DNA;洗脱峰的吸收低,未检出游离和聚集组分,衣壳强度 100%、满衣壳 85%。

作者同时写明这组数据的用法边界。空满比的计算假定目标衣壳和聚集体的空满比例相同;当衣壳相关蛋白的量很低时这个假定不成立。流穿液样品就是例子:其中并未检出装配好的衣壳,报出的空满比却因游离和聚集的蛋白与 DNA 偏高。未纯化的中间样品因此只用于定性比较,不用于精确定量。

浓缩带来的变化也能看到:某支载体浓缩 36 倍后,主峰从 24.5 nm、衣壳强度 92.2% 变成 20–700 nm 的宽峰,衣壳强度降至 34.9%、聚集体强度升至 64.9%,并出现 4 nm、强度 0.2% 的小颗粒峰。峰太宽时软件不再给出衣壳直径。

配方筛选中,它与 ddPCR 给出同一条稳定性趋势

Li 等的平台 40 分钟配出 96 个配方,每块板的 AAV 加样 20 分钟。先用 AAV8 做一致性核对:同一配方缓冲液铺满 96 孔,实测基因组滴度的变异系数为 4.2%。随后的筛选用 AAV1,共 128 个配方,覆盖醋酸盐、磷酸盐、Tris 三种缓冲体系和多种辅料。

对照实验取两个约 1.2 × 10¹⁴ vg/mL 的 AAV1 配方,5 °C 放置一个月,中途取样。样品 1 的基因组滴度和粒径变化都很小;样品 2 的滴度回收率明显下降、粒径明显增大。Stunner 与 ddPCR、单样品 DLS 的绝对值有小幅差异,趋势一致。作者据此在后续筛选中用它读 128 个配方的滴度回收率和粒径变化。

Figure 2. 引自 Li 等 2026 Figure 4。两个 AAV1 配方(1.2 × 10¹⁴ vg/mL)在 5 °C 放置一个月。(a) 基因组滴度回收率:Stunner(n = 3)与 ddPCR(n = 4),样品 1 的两条曲线在一个月时均接近 100%,样品 2 降至 70%–80%。(b) 粒径变化倍数:Stunner(n = 3)与单样品 DLS(n = 5),样品 1 维持在 1 倍,样品 2 升至约 2–2.6 倍。实线为 Stunner,虚线为对照方法。

能用它读什么,取决于样品处在哪一步

三篇论文的共同口径:纯化后、满足四条判据、碘克沙醇已降下来的样品,可以用它定量滴度和空满比,结果与 ddPCR、qPCR、ELISA、冷冻电镜可以相互印证。未纯化的工艺中间样品用于定性比较和趋势判断。配方和稳定性筛选中,它与 ddPCR 和单样品 DLS 给出同一条趋势。

Liu 等把它定位为批放行方法之外的补充工具,并写明它不替代 PCR、SDS-PAGE 和分析超速离心这类标准放行检测。

References

  • Liu X, Jean-Gilles R, Baginski J, Cai C, Yan R, Zhang L, Lance K, van der Loo JCM, Davidson BL. Evaluation of a rapid multi-attribute combinatorial high-throughput UV-Vis/DLS/SLS analytical platform for rAAV quantification and characterization. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 2024;32:101298. doi:10.1016/j.omtm.2024.101298
  • Yang QE, Walton RW, Kudrolli T, Denys N, Lance K, Chang A. Rapid quality control assessment of adeno-associated virus vectors via Stunner. GEN Biotechnology. 2022;1(3):300–308. doi:10.1089/genbio.2022.0007
  • Li S, Wang X, Li Z, Shameem M, Liu D. A high-throughput automation platform for accelerated AAV stability optimization. Pharmaceutics. 2026;18:608. doi:10.3390/pharmaceutics18050608
  • formulation · 制剂稳定性趋势