【Webinar】单抗浓度从 0.03 到 176 mg/mL 不稀释：GSK 用 Lunatic 完成方法确认

关于本次 Webinar

GSK 研发实验室的常规检测组每月收到工艺组送来的大量样品，浓度分析成为关键瓶颈。他们需要一个高通量、宽范围的蛋白浓度方法，并把范围延伸到 0.2 mg/mL 以下。

分析开发高级科学家 Erin K. Wilson 讲解 Lunatic 方法的确认过程。评估项目包括准确度、精密度、线性、专属性和耐用性，确认范围为 0.03–176 mg/mL。样品不需要稀释，每个样品用量 2 µL。本场录制于 2022 年 10 月，由 American Pharmaceutical Review 主办。

### 本场内容

- 低于 0.2 mg/mL 时，蛋白损失和聚山梨酯 80 杂质的处理方法

- Unmix Protein Lysates 应用的方法参数和谱图判读

- 准确度、精密度、线性、专属性和耐用性的研究设计与结果

- 下游工艺各阶段样品基质的确认结果

低浓度段的干扰来自聚山梨酯 80 杂质，Unmix 将其分离

低于 0.2 mg/mL 时，即使使用低吸附管，蛋白仍有损失。稀释液中加入聚山梨酯 80 后损失减少，但其低水平杂质使 A280 升高，影响 0.1 mg/mL 以下的准确度。

GSK 因此选用 Unmix Protein Lysates 应用。该应用分析样品的光谱形状，把蛋白、杂质和浊度背景分开，再由蛋白谱线的 A280 峰值和 E1% 计算浓度。GSK 方法自设的接受标准是残差不超过 5%，软件告警线为 2.5%。Wilson 在问答中说明，使用前不需要先测杂质。

15 个浓度水平的准确度都在接受标准以内

0.21 mg/mL 以上的样品与对照方法比较，以下的样品与加标法的理论浓度比较。所有水平的百分差值都低于 10%，最大为 6.5%。

重复性 %RSD 在 176.72 mg/mL 时为 0.8%，在 0.03 mg/mL 时为 14.0%，都满足接受标准。线性回归的 R² 为 0.99997。中间精密度在两个实验室评估，耐用性用全因子实验评估，所有因子效应都低于 3%。

下游工艺各阶段的样品基质同样通过确认

GSK 另外评估了 6 种基质，包括亲和、HIC 和阴离子交换步骤的样品，Lunatic 测得浓度为 6.52–49.71 mg/mL。与对照方法的百分差值为 0.0–2.4%，重复性和中间精密度的 %RSD 都不超过 0.3%。

00:00:00 · 00:01:46 · 开场：本场内容与讲者 · 主持人 Mike Auerbach 介绍本场内容和讲者 Erin Wilson。
00:01:46 · 00:02:57 · 浓度分析成为检测瓶颈 · 研发实验室样品量大，GSK 要一个高通量、宽范围的方法，并把范围延伸到 0.2 mg/mL 以下。
00:02:57 · 00:03:39 · Lunatic 怎么测 · 2 µL 样品，微流控板上高速采集 UV-Vis 光谱，校正散射后用 A280 和消光系数计算浓度。
00:03:39 · 00:04:44 · 整条光谱分析与对照方法的测量方式 · 对照方法在多个光程下测 A280；Lunatic 采集 230–450 nm 整条光谱，用样品浊度校正背景。
00:04:44 · 00:06:53 · 理论基础与仪器光路 · 比尔-朗伯定律、Pace 法消光系数、Lunatic 光路，以及 High Lunatic Plate 的 0.1 mm 和 0.7 mm 双光程。
00:06:53 · 00:07:43 · 低浓度段：蛋白损失和聚山梨酯 80 杂质 · 加标法配制低浓度样品；低吸附管加聚山梨酯 80 减少蛋白损失，但其杂质抬高 A280。
00:07:43 · 00:10:13 · 方法参数与 Unmix 谱图判读 · Unmix Protein Lysates 应用，样品 2 µL，用水做空白；蛋白、杂质、背景和残差四条谱线分别代表什么。
00:10:13 · 00:10:45 · 确认的接受标准 · 准确度、精密度、专属性和线性的接受标准，精密度用嵌套设计，耐用性用全因子设计。
00:10:45 · 00:12:14 · 准确度、重复性和线性 · 15 个浓度水平的百分差值都低于 10%，重复性满足接受标准，线性 R² 为 0.99997。
00:12:14 · 00:14:34 · 中间精密度、专属性和耐用性 · 两个实验室的 %RSD 都满足标准；稀释液和制剂缓冲液不贡献蛋白浓度；所有因子效应低于 3%。
00:14:34 · 00:15:51 · 中间过程样品的确认 · 亲和、HIC、阴离子交换等步骤的样品基质，准确度和精密度都满足接受标准。
00:15:51 · 00:16:42 · 结论 · 方法通过确认，范围 0.03–176 mg/mL，结果与平台方法可比，并覆盖平台方法已验证范围以下的低浓度段。
00:16:42 · 00:23:53 · Q&A · 操作和软件、下游工作怎么用、其他应用、Unmix 要不要先测杂质、液体工作站加样、未纯化上清、浓度范围和稀释。