比色法怎么建标准曲线，仪器读数准不准怎么验

BCA、Bradford、Lowry 这类比色法没有固定消光系数，没法像直接定量那样套 Beer-Lambert 定律，浓度和显色之间的关系要靠标准曲线来建。Lunatic 用同一实验里的参考品拟合这条曲线，拟合模型有 6 种可选。曲线再好，前提也是仪器读数本身准确：仪器用久了或搬动过之后，要用 OD Check 和 Fundamentals Check 确认读数。

标准曲线：用已知浓度推未知浓度

在板上同时放一组已知浓度的参考品和待测样品。Lunatic 测完所有孔位的 OD 值后，软件用参考品的"OD–浓度"关系拟合出一条标准曲线，再从曲线上反推待测样品的浓度。

建实验时和直接定量的区别只有两步：

板布局界面要额外标出参考品孔位（橙色 R 按钮）
样品编辑界面要给每个参考品填入已知浓度值，还要选曲线拟合方式和检测波长

一个实验只能建一条标准曲线，所有待测样品用同一条曲线算浓度。参考品可以分散在不同板上，位置不限，但所有样品的浓度都要等曲线建好才能算。因此，如果测量中途中断了，而参考品还没测到，所有待测样品都不会有浓度结果。

参考品本身还要注意：

建议参考品做重复（尤其是低浓度和高浓度端），提高曲线精度
之前做过的标准曲线可以保存下来复用，但标准品会老化，建议每次实验都带上新鲜的参考品

标准曲线的样品编辑界面。顶部选择拟合方式、浓度单位和检测波长，列表下方的参考品行需要填入已知浓度值。

6 种拟合模型怎么选

样品编辑界面顶部可以选拟合方式，一共 6 种。怎么选取决于标准品的浓度范围和检测方法的响应曲线形状：

模型 / 方程 / 适用场景

Proportional:方程 OD = A × conc;适用场景过原点的纯线性关系

Linear:方程 OD = A × conc + B;适用场景线性但有截距

Point-to-point:方程分段线性;适用场景相邻标准点之间逐段连线，非线性检测方法的简单近似

Quadratic:方程 OD = A × conc² + B × conc + C;适用场景轻微弯曲的响应曲线

Quadratic (0,0):方程 OD = A × conc² + B × conc;适用场景同上，强制过原点

4-parameter:方程 OD = (A-D) / [1+(conc/C)^B] + D;适用场景 S 型剂量-响应曲线，ELISA 等免疫分析常用

浓度跨度大、响应曲线明显弯曲时，试二次多项式或四参数。不确定的话先用一次线性跑一遍，看 R² 和残差，拟合不好再换。

荧光标记样品：先把染料的吸收扣出来

标准曲线对付的是没有消光系数的比色法，荧光标记样品的麻烦在另一头。Cy5.5、Alexa Fluor 555/647、DyLight 649 这类染料本身在紫外-可见光区有吸收，会干扰常规 A260/A280 定量。软件里的 Labeled（荧光标记）应用会同时考虑染料和目标分子各自的吸收贡献，分别报告浓度。

软件内置了 4 种常见染料的参数，不在列表里的染料可以手动添加。添加时输入消光系数、吸收波长和校正系数即可。

OD Check：验证 350 nm 处的读数是否准确

OD Check 用 NIST 可溯源的重铬酸钾（K₂Cr₂O₇）标准品验证仪器在 350 nm 处的吸光度准确度。标准品是 Unchained Labs 提供的即用型溶液，瓶身上印着目标吸光度值。

建议每 6 个月做一次，搬动过仪器后也要立刻补做。

### 操作步骤

- Client 主界面选 Other → OD check

- 板布局是固定的：A1 放超纯水，A2–H2 放重铬酸钾标准品。一条 Strip 就够

- 在样品编辑界面输入瓶身上的目标吸光度值

- 装板、开始测量

测完后软件报告测量值和目标值之间的偏差。超出规格说明仪器需要重新校准，这时联系 Unchained Labs 安排。

OD Check 样品编辑界面。左侧是固定板布局（A1 放水，A2–H2 放标准品），右侧输入瓶身上的目标吸光度。

Fundamentals Check：同时验证精度、准确度和线性

OD Check 只验 350 nm 一个点，Fundamentals Check 覆盖更多：5 个浓度梯度的 L-色氨酸标准品（E1% = 271.5）铺满整块 High Lunatic Plate，一次同时验精度、准确度和线性。

### 操作步骤

- Client 主界面选 Other → Fundamentals check

- 板类型选 High Lunatic Plate

- 板布局是预设的色块编码。第 1–2 列放水，第 3–12 列按 A–E 五个浓度梯度分配，每个浓度 16 个重复

- 从 Fundamentals Kit（产品号 701-2029）的标签上把目标浓度和不确定度抄到软件里

- 每个标准品和水各加 2 µL 到对应孔位

- 装板、开始测量

结果自动判定通过/不通过，三个指标全部达标才算通过：

指标 / Pass 标准 / 验什么

平均回收率:Pass 标准 97.3–102.7%;验什么准确度：测出来的浓度和标称浓度差多少

相对标准偏差（RSD）:Pass 标准 0–1.0%;验什么精密度：16 个重复之间的离散程度

决定系数（R²）:Pass 标准 0.995–1.000;验什么线性：5 个浓度点拟合直线的相关性

Fundamentals Check 结果。Overview 界面用色块显示每个孔位的通过/不通过状态。底部汇总三个指标的合格标准。

UV/Vis 性能验证（药典合规）

从 Client 软件 v7.0 开始，Lunatic 支持基于有证标准物质（CRM）的 UV/Vis 性能验证。它可以满足 USP 42 <857> 和欧洲药典 Ph. Eur. 2.2.25 的合规要求。

验证用的是一套 Hellma 密封石英比色皿，装在专用金属板架上（最多 8 个），放进 Lunatic 就能读。一共验 6 项：

吸光度准确度 — 3 个浓度的重铬酸钾溶液
吸光度精密度 — 6 次重复读数的标准偏差和相对标准偏差
吸光度线性 — R² ≥ 0.999
波长准确度 — 氧化钬的特征峰位置（241、287、361、537、641 nm）
杂散光 — 丙酮在 250–330 nm 吸收带外的残余信号
分辨率 — 甲苯/正己烷溶液的 269/266 nm 峰谷比

UV/Vis 性能验证和 OD Check、Fundamentals Check 的定位不同。OD Check 用一条 Lunatic Plate Strip，Fundamentals Check 用整块 High Lunatic Plate，都是一次性耗材，验证的是仪器在日常测量条件下的性能，属于用户层面的质控。UV/Vis 性能验证用可重复使用的 CRM 比色皿，验证光谱仪本身的硬件指标，并直接对标药典，属于仪器层面的确认。GxP 实验室通常两套都做，周期都是 6 个月或搬运之后。

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