Homebrew:Lunatic 上做统计,Stunner 上测粘度

Homebrew:在 Lunatic 上自动算统计,在 Stunner 上用 DLS 测粘度

Lunatic 和 Stunner 都会采集样品的完整 UV/Vis 吸收光谱,默认用 A280 算蛋白浓度。但吸收光谱里的信息远不止 A280 一个数,Homebrew 就是用来自定义光谱分析参数的工具。它内置在 Lunatic & Stunner Client 软件里,可以选波长、选消光系数、选背景校正方式、自定义计算公式,还能对重复样品做统计(均值、SD、CV)。在 Stunner 上,Homebrew 还能调用 DLS 数据(比如用已知粒径的 NIST 标准珠反算溶液粘度)。

A. Lunatic:UV/Vis 蛋白定量,0.02–200 mg/mL,2 µL。B. Stunner:UV/Vis + DLS,浓度和粒径同时测。两者共享 Homebrew 功能。

Homebrew 能设置什么

Homebrew 的 Settings 界面可以设置样品类型(蛋白、DNA、RNA 等)、关注的波长、可见光波长范围,以及消光系数。样品类型还决定了后续计算是用蛋白的 E1% 还是核酸的浓度换算系数。同一份光谱数据可以先用默认蛋白应用分析,再切到 Homebrew 重新按自定义参数分析,不需要重新测量。

背景校正有 5 种选项:

Homebrew Settings 界面:样品类型、关注波长、消光系数选项和 5 种背景校正方式。

Lunatic 上的 Homebrew:重复样品一键出均值、SD、CV

评估定量精度要做重复测量,这类统计可以直接交给 Homebrew。Output 界面用内置的统计函数(均值、SD、CV、中位数、最大/最小值等)对同名重复样品做自动统计,不用导出到 Excel 手动算。还可以用算术和代数函数做自定义计算,引用特定波长的吸光度值。

默认蛋白应用的浓度公式是:Concentration = A280 / E1% × 10。其中 E1% = ε × 10 / MW(ε 是摩尔消光系数,MW 是分子量)。

Output 界面:蓝色按钮 = 统计函数,深灰色 = 算术运算,浅灰色 = 代数函数,黄色 = 特定波长吸光度值。自定义输出列在左侧。

实验

样品:Bovine IgG(bIgG)1 mg/mL 和 10 mg/mL,PBS 缓冲液。

上样:2 µL × 三次重复 + PBS 空白,High Lunatic 板。

分析:Homebrew 蛋白应用,浊度背景校正,E1% = 13.7。

自定义输出:Concentration、Average Concentration、StDev Concentration、CV Concentration。

10 mg/mL bIgG 三次重复的 Homebrew 结果:浓度 10.00 mg/mL,均值 10.02 mg/mL,SD 0.09,CV 0.01(软件以小数显示,即 1%)。光谱和统计在同一个界面显示。

Stunner 上的 Homebrew:用 DLS + NIST 标准珠测粘度

传统粘度计需要大量样品,早期筛选阶段往往样品不够用。Stunner 的 Homebrew 因此改用 DLS 反过来测粘度:把已知粒径的 NIST 标准珠(100 nm)加到溶液里,DLS 测出珠子的扩散系数,再用 Stokes-Einstein 方程反算粘度。

Viscosity = kBT / (6πDRH)

Stunner 上的 Homebrew 包含 Lunatic 的全部功能,另加一个 DLS 选项:在 Settings 里勾选「Include Sizing results」,就能在 Output 里引用 DLS 的扩散系数、粒径等变量。珠子选 100 nm,比 IgG 单体(10–12 nm)大得多,两者在 DLS 强度分布上很容易区分,Homebrew 可以指定只取珠子那个峰的扩散系数来算粘度。

A. Settings 中勾选 Include Sizing results,设置峰筛选范围。B. Output 中 DLS 变量(扩散系数、粒径等)可直接用于自定义公式。

实验

甘油验证:100 nm NIST 珠加入 PBS + 甘油(0%、6%、13%、20%、25%、33% m/v)。2 µL × 三次重复,4 次 DLS 采集 × 5 秒。Homebrew 用 Stokes-Einstein 算粘度。

IgG 粘度:100 nm NIST 珠加入 0–100 mg/mL 单抗溶液(20 mM His-HCl,150 mM Arg-HCl,pH 6)。同时用 RheoSense µVISC 粘度计做对照。

PBS + 不同浓度甘油的粘度:Stunner Homebrew(绿色)vs CRC 手册发布值(蓝色)。

甘油系列各浓度点上,Stunner 测值都和 CRC 手册值相近;差得最多的是 33% 甘油,两者约为 2.5 cP 和 2.6 cP。换成 IgG 溶液,DLS 强度分布上抗体峰(10–12 nm)和 NIST 珠峰(~100 nm)清晰分开,Homebrew 只取珠子峰的扩散系数算粘度。0–100 mg/mL 范围内,Stunner 和 RheoSense 粘度计的测值随浓度一起上升,到 100 mg/mL 时两者都约为 3 cP。

A. 0.5 mg/mL IgG + NIST 珠的 DLS 强度分布:蓝框 = 抗体峰,绿框 = NIST 珠峰,两者清晰分开。B. 不同浓度 IgG 的粘度:Stunner(绿色)vs 粘度计(灰色),20 mM His-HCl + 150 mM Arg-HCl pH 6.0。

只用 2 µL 样品,就能在早期筛选阶段了解不同配方对粘度的影响,不需要等到有大量样品再跑粘度计。结合 Stunner 的 B₂₂ & kD 应用,可以在同一台仪器上同时评估胶体稳定性和粘度。

同一个 Homebrew,两种用法

两台设备上,背景校正、统计函数和输出公式的用法一致,在 Lunatic 上用熟的方法到 Stunner 上照样适用。

References