【Webinar】慢病毒滴度上去了，完整颗粒占比却没变：Leprechaun 一次测出衣壳、RNA 和杂质

关于本次 Webinar

p24 ELISA 测衣壳，qRT-PCR 测基因组，两者各看慢病毒的一个组分，看不出这个组分是否在完整颗粒里，也看不出样品里有哪些杂质。转导实验能回答病毒有没有功能，但要花较长时间。体内 CAR-T 疗法把慢病毒直接给患者施用，样品里缺衣壳、缺 RNA 的颗粒和游离杂质有多少，变得更要紧。

Leprechaun 先用 LUNI 上的捕获抗体把慢病毒从溶液里拉下来，粗样品也能直接测。干涉成像给出 35–200 nm 颗粒的粒径，免疫荧光共定位判断每个颗粒带不带 p24 衣壳和 RNA。软件据此把颗粒分成完整慢病毒、缺组分颗粒、空颗粒和聚集体，分别给出滴度和粒径分布。非 VSV-G 假型可以用 Flex 试剂盒，把自己的捕获抗体偶联到试剂盒提供的连接子上。

讲者用纯化工艺样品说明完整颗粒占比的用处。同一组样品，ELISA 和 qRT-PCR 的滴度都在逐步上升，Leprechaun 测出的完整慢病毒占比却一直在 12% 到 15%。这说明工艺把完整慢病毒和不完整颗粒一起富集了。之后是两个定制实验：检测表面表达的 CD19 CAR，以及用 EV 杂质试剂盒同时测 EV 和可溶性 p24。最后约 8 分钟是 Q&A，涉及 RNA 检测原理、荧光强度、定制抗体、荧光基团选择、p24 检测和适用颗粒。

### 你将了解到

• 00:00:00 · 00:01:18 · 开场：雾中降落靠仪表 · 讲者用浓雾机场作比：飞行员看不见跑道，靠驾驶舱仪表照常进近。慢病毒表征也要靠合适的仪器，看到直接看样品时看不到的信息。
• 00:01:18 · 00:03:07 · 传统方法各看一个组分 · p24 ELISA 和 qRT-PCR 各测一个组分，看不出病毒结构；转导实验是金标准，但耗时长。体内 CAR-T 疗法直接给患者施用慢病毒，样品质量更受重视。
• 00:03:07 · 00:05:44 · 原理：LUNI 捕获、干涉成像、免疫荧光 · LUNI 上的捕获抗体把颗粒从溶液里拉出来，粗样品也能测，一次最多 16 个 LUNI。干涉成像测 35–200 nm 颗粒的粒径，荧光共定位判断每个颗粒带哪些组分。
• 00:05:44 · 00:10:22 · 试剂盒：RNA、EV 杂质、Flex 与定制 · Lenti RNA 试剂盒有 VSV-G 或定制捕获点、可溶性 p24 捕获点和同型对照，每种捕获点有多个技术重复。EV 杂质试剂盒加了四跨膜蛋白捕获点。非 VSV-G 假型用 Flex 试剂盒，把自己的捕获抗体偶联到我们提供的连接子上。
• 00:10:22 · 00:12:57 · 读数据：按共定位分群、看完整颗粒占比 · RNA 蓝色、p24 衣壳红色，共定位为粉色点，软件据此分出完整、缺组分、空颗粒和聚集体，扫完即出结果。示例中各样品完整慢病毒占比在 35% 到 42% 之间。
• 00:12:57 · 00:15:51 · 纯化工艺：滴度上升不等于完整颗粒占比提高 · 同一组中间过程样品，ELISA 和 qRT-PCR 都显示滴度逐步上升；Leprechaun 显示完整慢病毒占比一直在 12% 到 15%，工艺还有优化空间。另一个工艺里总滴度和完整颗粒占比同时上升。
• 00:15:51 · 00:18:00 · 定制实验：测 CAR 外泄表达 · CAR 应只编码在 RNA 里；表达到病毒表面会失去靶向性，导致脱靶转导。用红色荧光抗体检测表面 CD19 CAR，比较用和不用某种减少外泄的转染试剂。
• 00:18:00 · 00:20:11 · EV 杂质与可溶性 p24 · EV 和慢病毒大小、密度相近，常一起纯化出来，但携带宿主核酸等不同内容物。EV 杂质试剂盒在同一个实验里给出 EV 和可溶性 p24 的滴度。差样品约 90% 颗粒是 EV，好样品完整慢病毒约占 40% 到 50%。
• 00:20:11 · 00:21:51 · 总结：滴度、结构、工艺优化与杂质 · Leprechaun 给出慢病毒滴度和结构信息，实验设计灵活，粗样品也能测，可用来优化纯化工艺和检测 EV、可溶性 p24 等杂质。
• 00:21:51 · 00:30:06 · Q&A：RNA 检测、荧光强度、定制抗体与适用颗粒 · RNA 用通用核酸染料，也有客户用反义荧光探针做基因特异性检测；荧光强度与核酸量相关。定制捕获抗体在自己实验室偶联，再孵育 1 小时。蓝、绿、红三种激发光源；检测 p24 要先固定和通透。只要粒径在 35–200 nm、能用捕获抗体结合，EV 和其他病毒也能测。
• 看懂 Leprechaun 怎样用捕获、干涉成像和荧光共定位，逐个判断慢病毒颗粒带不带衣壳和 RNA
• 了解 RNA、EV 杂质和 Flex 三类试剂盒各测什么，非 VSV-G 假型怎么做
• 学会用完整慢病毒占比判断纯化工艺是否在富集完整慢病毒
• 了解如何检测 CAR 外泄表达，以及 EV、可溶性 p24 等杂质