每个 Luni 在 Leprechaun Client 里要先后扫描:样品孵育前做背景扫描,孵育后做样品扫描。Client 控制仪器、管理整个扫描流程,单次运行最多 16 个 Luni;扫描完成后,数据导出到 Analysis 处理。
启动 Client 前必须先开启仪器电源。连接是否正常,看主界面上的连接状态指示;出错时的处理方法见下方列表。
启动 Client 后进入主界面(Home Screen)。这里显示仪器连接状态,并提供 Background Scan 和 Sample Scan 两个入口。
主界面:Options 菜单、Eject Stage、连接状态、磁盘空间提示、扫描按钮
主界面上的关键信息和操作:
点击左上角的菜单按钮打开 Options 菜单,包含三个选项:
Options 菜单
About 对话框:仪器序列号和软件版本
所有 Luni 必须在样品孵育前完成背景扫描。背景扫描数据自动保存,无需指定保存位置。
未完成背景扫描的 Luni 在样品扫描时无法选择。
在主界面点击「Background Scan」按钮。
选择 Background Scan
三种应用类型可选:Lentivirus、Exosome、Custom。
选择应用类型
Custom 应用仅与 Leprechaun Flex Kits 兼容。
2.1 Lentivirus:选择病毒假型(VSVG 或 Non-VSVG)。
选择病毒假型(VSVG / Non-VSVG)
接着选择分析类型,须与试剂盒类型匹配(RNA 或 EV Contaminants)。
选择分析类型(RNA 或 EV Contaminants)
2.2 Exosome:选择试剂盒类型(Human Tetraspanin、Human Tetraspanin Flex、Human Plasma、Human Plasma Flex、Mouse Tetraspanin)。
选择外泌体试剂盒类型
Kit Selection 界面列出所有已导入且匹配所选应用类型的试剂盒。每个试剂盒显示可用的 Luni 数量(Lunis Available)。
Kit Selection 界面
Kit Selection 详细视图
导入试剂盒(Import Kits):首次使用或列表中没有该试剂盒时,点击 Import Kits。然后导航到 Lunifile 文件夹,其名称与试剂盒正面打印的 ID 一致。选择文件夹后点击「打开」完成导入。
Lunifile 文件夹(名称与试剂盒 ID 一致)
Lunifile 文件夹无需解压即可使用。选择了非 Lunifile 文件夹时,系统会弹出警告,该文件夹不会被导入。
选择错误文件类型时的警告
删除试剂盒(Remove Kits):勾选试剂盒 ID 左侧的复选框,然后点击 Remove Kits。需要时可从原始 USB 重新导入。
选择试剂盒 ID,点击 Next 继续。
选择试剂盒 ID,点击 Next
左侧列出所选试剂盒的全部可用 Luni。点击选择 Luni 后点击 Add Luni,Luni 从 Lunis Available 移动到 Selected Lunis 列表。可拖选连续 Luni,也可按住 Ctrl 选择不连续的。
单次运行最多 16 个 Luni。超过 16 个的不会被添加。
Luni 选择界面(最多 16 个)
Luni 选择界面
Luni 按数字顺序排入 Selected Lunis 列表。分批添加或删除后重新添加时,各批次内按数字顺序排列。
Selected Lunis 列表(按数字顺序排列)
添加 Luni
移除 Luni:点击高亮要移除的 Luni,点击 Remove Luni,它会重新出现在 Lunis Available 中。
选择 Luni 后点击 Back 会导致选择丢失。
点击 Back 的警告提示
需要背景扫描的 Luni 都添加完毕后,点击 Next。
Selected Lunis 按顺序自动分配支架位置。按 Client 显示的顺序将 Luni 放入支架。
Luni 装载位置指示
确保每个 Luni 上印刷的编号与软件分配的位置编号匹配。位置错误会导致扫描失败。
只有将 Luni 支架放到载物台上后,Start Scan 按钮才可用。点击即开始运行。
样品扫描前必须完成背景扫描。未做背景扫描的 Luni 不会出现在样品扫描的可选列表中。
选择 Sample Scan
名称须少于 50 个字符,只能包含字母和数字。
输入实验名称和保存位置
扫描期间数据应保存到仪器 PC 本地硬盘,扫描完成后再转移到远程位置。
文件路径超过 260 个字符时会弹出警告,须重新选择位置。保存位置不可用时同样会弹出警告。
路径过长警告
位置不可用警告
确认实验名称和保存位置后继续。
与背景扫描相同,选择 Lentivirus、Exosome 或 Custom。不论哪种应用,Client 中输入的自定义抗体名称都无法在 Analysis 中编辑,运行前务必确认名称正确。
样品扫描:选择应用类型
5.1 慢病毒实验设置
5.1.1 选择病毒假型(VSVG 或 Non-VSVG)。
选择病毒假型
5.1.2 选择分析类型,须与试剂盒匹配(RNA 或 EV Contaminants)。
选择分析类型
5.1.3 Non-VSVG 样品使用 Flex Kit 时,需输入 Flex 斑点关联的自定义抗体信息,然后点击 Next。
Flex Kit 自定义抗体设置
Flex 1 用于偶联针对自定义包膜蛋白的抗体,Flex 2 添加适当的同型对照。其他组合会导致实验设计无效。
5.1.4 审查实验设计摘要。需要修改时点击 Back 返回,确认无误点击 Next。
实验设计摘要
同一次样品扫描中的所有 Luni 必须使用相同的荧光抗体组合。不同实验设计的 Luni 需分别运行。
5.2 外泌体 / Custom 实验设置
5.2.1 选择试剂盒类型。
选择外泌体试剂盒类型
5.2.2 Custom 应用和外泌体 Flex 试剂盒需指定 Flex 斑点详细信息:
指定 Flex 斑点详细信息
Flex 1 斑点自定义抗体同型不是 MIgG1 时,Flex 2 必须偶联相关同型对照。MIgG1 同型的抗体可使用预点的 MIgG1 作为对照。
5.2.3 试剂盒抗体使用选择。使用试剂盒提供的 CD9/CD63/CD81 荧光抗体时,选 No。抗体被移除或被自定义替代时,选 Yes。
试剂盒抗体使用选择
单个四跨膜蛋白抗体被 pan-四跨膜蛋白抗体替换,或使用 syntenin 抗体做货物染色时,选 Yes。
5.2.4 自定义检测抗体设置:指定使用的荧光通道和每通道检测的标志物。使用 pan-四跨膜蛋白抗体(蓝色通道)时选 Custom,输入自定义标志物名称。Flex 斑点无需匹配的荧光抗体。
自定义检测抗体设置
使用自定义和试剂盒抗体混合时,在标志物下拉菜单中为试剂盒抗体通道选 CD9/CD81/CD63。
Channels in use 复选框未勾选时,相应荧光通道在扫描期间不采集。
5.2.5 选择样品孵育时间,点击 Next。
选择样品孵育时间
5.2.6 审查实验设计摘要,确认后点击 Next。
外泌体实验设计摘要
与背景扫描流程一致,但只显示已完成有效背景扫描的试剂盒。选择试剂盒 ID,点击 Next。
选择 Luni 并配置每个 Luni 的样品名称和稀释倍数。
稀释倍数必须与实际孵育时使用的值匹配,否则结果不准确。扫描前未输入正确值的,可在 Analysis 中更新。
样品名称和稀释倍数设置
点击 Next,按软件显示的顺序装载 Luni。将支架放到载物台上后,Start Scan 可用。
样品扫描 Luni 装载位置
确保 Luni 编号与软件分配的位置匹配。位置错误会导致扫描失败。
扫描进行时,每个 Luni 的状态通过颜色标识显示在表格和支架布局中:
颜色 / 含义 / 说明
绿色:含义 成功;说明 扫描完成,数据正常
浅蓝:含义 进行中;说明 当前正在扫描
深蓝:含义 排队中;说明 等待扫描
黄色:含义 请检查图像;说明 扫描完成,但数据未全部处理,标记为 unprocessed
红色:含义 失败;说明 Luni 放错位置、未放平,或相机 / 载台故障
黄色 Luni:扫描已完成,但软件没能把背景扫描对齐并扣除,数据未全部处理。最常见的原因是样品过浓,Luni 过载饱和。这类数据在 Analysis 中标记为 unprocessed(紫色警告三角),准确性可能受影响;它与橙色的饱和数据警告是两回事。
红色 Luni:扫描未完成。可能原因有三种:Luni 放错位置(状态栏显示 mismatched Luni ID)、Luni 没有放平、相机或载台故障。逐项排查见 Leprechaun 软件故障排除。
整体扫描进度在支架布局下方显示,包含完成百分比和剩余时间估算。
扫描进度:百分比和剩余时间
扫描进度详细视图
扫描进行时请勿在仪器 PC 上运行其他应用程序,否则可能干扰数据采集。扫描进行时也无法查看结果。
点击 Abort Scan,在弹出的 Cancel Scan 窗口中点 Yes 确认取消,或点 No 继续扫描。
Cancel Scan 确认弹窗
取消后,所有未成功扫描的 Luni 变为蓝色(排队中)。可点击 Retry Scan 重新扫描,或点击 Finish 完成实验(仅导出绿色和黄色 Luni 的数据)。
取消后 Luni 变为蓝色
取消扫描时若某个 Luni 正在扫描中,该 Luni 将无法重新扫描,导出数据可能不完整。
扫描结束后进入 Scan Complete 屏幕。绿色 = 成功,黄色 = 已扫描但未全部处理,红色 = 失败。
Scan Complete 屏幕
点击 Finish 导出数据到 Analysis。如果存在未成功的 Luni,会弹出警告窗口。点 Yes 确认导出(仅绿色和黄色 Luni),点 No 返回 Scan Complete 屏幕。
数据集不完整警告
导出不完整的数据集会在 Analysis 中缺少部分 Luni。导出后无法向同一实验添加额外 Luni。
未包含在导出中的红色(失败)或蓝色(排队)Luni 可在单独的实验中重新扫描。
导出完成后,软件返回主屏幕。
有 Luni 失败(红色)或取消后排队(蓝色)时,Scan Complete 屏幕上会出现 Retry Scan 选项。重新扫描的数据与成功 Luni 归入同一实验。
也可以选择 Finish,然后在新实验中使用失败的 Luni,数据会在单独的实验报告中。
Retry Scan 确认弹窗
重新扫描时不要移动 Luni 在支架中的位置,仪器假定 Luni 处于原始扫描时的相同位置。
点击任意屏幕右上角的关闭按钮(X),弹出 Exit Software 窗口:点 Yes 退出,点 No 返回上一屏幕。
Exit Software 弹窗
扫描进行中无法退出 Client。