【Webinar】破解蛋白配方密码：Aunty 一次升温给出 Tm 和 Tagg，再用 kD / B22 和冻融挑出更稳定的配方

关于本次 Webinar

蛋白稳定不稳定，取决于两件事：什么温度开始去折叠，什么条件下开始聚集。要优化配方，两组数据都得拿到。讲者 Andre Mueller 用一款猜密码的桌游开场，把配方开发比作破解蛋白稳定性的密码。

Aunty 在一台仪器里结合全光谱 DSF、SLS 和 DLS。每孔 8 µL，96 孔 SBS 石英板每分钟读完一遍，一次升温同时给出 Tm、Tonset、Tagg 和 Tsize。同一块板还能测 kD、B22 和 G22，样品密封在孔里，也可以做等温长期跟踪。

案例用阿达木单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗和碳酸酐酶，按部分因子设计配出 8 个配方，共 32 个条件。板热图直接给出四个蛋白的稳定性排序；DoE 分析显示 pH 7 普遍优于 pH 5.5。kD / B22 实验里，聚山梨酯 80 有利于胶体稳定、精氨酸不利，和升温结果互补。三轮冻融后，含精氨酸的配方让碳酸酐酶的 Tagg 明显变化。最后约 11 分钟是问答，涉及检测下限、浓度梯度怎么设、等温测试和自动化集成。

站内另一场 Aunty webinar 讲 ADC 和外源染料： 蛋白和 ADC 配方筛选：8 µL 测热稳定和聚集。

### 你将了解到

• 00:00:00 · 00:01:42 · 开场与讲者介绍 · The Scientist 主持人 Iris 介绍讲者 Andre Mueller。他是 Unchained Labs 产品管理总监，负责 Aunty 和 Honeybun，专长是用荧光、SLS 和 DLS 做蛋白与病毒载体的生物物理表征。
• 00:01:42 · 00:02:37 · 从猜密码游戏说起 · 讲者用桌游 Codebreaker 打比方：配方开发就像破解蛋白稳定性的密码，要用尽量少的尝试找到答案。
• 00:02:37 · 00:03:33 · 稳定性密码由两部分组成 · 构象稳定性看蛋白何时去折叠、失去天然结构；胶体稳定性看蛋白何时聚集。聚集可以从折叠态、去折叠态或中间态发生。
• 00:03:33 · 00:05:04 · 一次升温拿到 Tm、Tonset、Tagg 和 Tsize · 全光谱 DSF 采集 250–750 nm 的整段发射光谱，给出 Tonset 和 Tm。同时用 SLS 定 Tagg、用 DLS 定 Tsize。蛋白没有内源荧光时，可改看报告染料。
• 00:05:04 · 00:06:36 · kD、B22、G22 与长期稳定性 · kD 来自 DLS，B22 来自 SLS，适合 IgG 1–10 mg/mL 的稀溶液。高浓度时看 G22（Kirkwood-Buff 积分）。样品在板里密封，还能长时间跟踪荧光和光散射。
• 00:06:36 · 00:08:14 · 每孔 8 µL，每分钟读完整板 · 96 孔板从 A1 到 H12 一分钟读完，升温程序里每分钟都有一次整板数据；有 API，可全天候自动运行。荧光用 280 nm 和 470 nm 两个光源激发，分别对应内源荧光和 SYPRO Orange 等染料，CPM 染料也能用。
• 00:08:14 · 00:08:40 · 独立的光散射光路 · 光散射用 660 nm 红色激光，SLS 和 DLS 并行采集。SLS 对聚集体形成最灵敏，摩尔质量增加 15 kDa 即可检出。
• 00:08:40 · 00:10:11 · Aunty 板：SBS 标准的石英板 · 黑色 SBS 外框上装 6 块石英芯片，每块 16 个样品，孔距 9 mm，可直接用多道移液器或移液机器人上样。三层石英结构，光学和化学兼容性好、材质惰性。
• 00:10:11 · 00:11:44 · 上样演示与封板 · 用荧光素水溶液演示：样品滴进进样孔就自己流进去。封板膜盖住进样孔和排气孔，测量区开窗不挡光路；铜块从下方控温。一块板可以按芯片分次使用，直到全部孔用完。
• 00:11:44 · 00:13:19 · 用 BCM 曲线定 Tm · 升温时芳香族残基暴露到水环境，荧光重心平均波长（BCM）红移；对曲线求导找拐点即为 Tm。默认在 310–370 nm 范围积分，信号高、噪声低。
• 00:13:19 · 00:14:46 · SLS 定 Tagg，DLS 定 Tsize · SLS 基线平稳，聚集开始后信号上升；密封孔内浓度不变，上升来自摩尔质量增加。DLS 作为第二个正交指标，看平均直径增大。两个判定阈值都可由用户调整。
• 00:14:46 · 00:15:47 · 同一蛋白两种配方：聚集跟着哪一步去折叠走 · 配方 1 只有一次去折叠，聚集与它同步发生；配方 2 加了少量氯化钠，出现两次去折叠，只有第二个结构域去折叠时才引发聚集。去折叠和聚集两组数据要一起看。
• 00:15:47 · 00:17:56 · 案例：3 个单抗加碳酸酐酶，8 个配方 · 阿达木单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗和碳酸酐酶，用 5 因素两水平、分辨率 III 的部分因子设计。缓冲液为 pH 5.5 或 7 的组氨酸缓冲液，精氨酸、氯化钠、蔗糖、聚山梨酯 80 各设加与不加；4 个蛋白乘 8 个配方，共 32 个条件。
• 00:17:56 · 00:19:14 · 用超滤 / 渗滤平台换液 · Unfilter 96 孔板底部有膜，加压把液体压过膜、补入目标缓冲液，循环到需要的置换度，最后还能浓缩。单样品、24 或 96 样品都能做，人工操作约 15 分钟。
• 00:19:14 · 00:21:08 · 热图：稳定性排序一眼看出 · Aunty 软件的板热图显示：曲妥珠单抗最稳定，其次是阿达木单抗、利妥昔单抗，碳酸酐酶最不稳定。上样随机化，同一配方的重复孔 Tm 吻合很好；Tagg 热图给出同样的排序。
• 00:21:08 · 00:22:47 · DoE 结果：辅料效应与 pH · 精氨酸提高曲妥珠单抗的 Tm、降低利妥昔单抗的 Tm，并提高所有样品的 Tagg。pH 7 普遍优于 pH 5.5，用等电点（pI）解释得通。单抗 pI 约 8.3–8.7，pH 7 离得够远；碳酸酐酶 pI 约 5.4，pH 5.5 时几乎不带净电荷。
• 00:22:47 · 00:25:43 · kD / B22：浓度梯度给出另一面 · 以利妥昔单抗为例，配方 3 和 7 的 kD、B22 斜率为正，分子间相互排斥，长期更稳定。在这组实验里聚山梨酯 80 有利于胶体稳定、精氨酸不利，和升温结果互补：先用升温筛掉弱候选，再用浓度梯度细看。
• 00:25:43 · 00:27:39 · 冻融三轮后：精氨酸让碳酸酐酶对冷冻更敏感 · 三轮冻融后整体趋势与冻融前一致。碳酸酐酶在含精氨酸的配方 2 和 6 中 Tagg 明显变化。配方 4 和 8 里精氨酸与氯化钠或聚山梨酯 80 同时存在，这种效应得到缓解。
• 00:27:39 · 00:28:47 · 小结与自动化 · Aunty 在一台仪器里结合 DSF、SLS 和 DLS，石英 96 孔板、读板快。演示里用 Opentrons 移液机器人上样，封板机自动封板，机械夹爪把板送进 Aunty。API 遵循 SiLA 2.0 标准。
• 00:28:47 · 00:29:49 · 和 Honeybun、Stunner、Lil' Tuna 搭配 · Honeybun 测粘度，最多 10 个样品并行；Stunner 结合 UV-Vis 和 DLS 测浓度和粒径；Lil' Tuna 做全自动换液，单样品、24 或 96 样品都行。
• 00:29:49 · 00:31:48 · Q&A：Aunty 板怎么用、怎么上样 · 一块板可以分次用到 96 孔全部用完。上样时枪头停在进样孔口上方一点点，石英浸润性好，样品会自己流进去。系统可用于 GMP 实验室。
• 00:31:48 · 00:32:42 · Q&A：检测下限 · 以曲妥珠单抗计，全光谱 DSF 检测下限约 0.025 mg/mL（25 µg/mL），SLS 约 0.05 mg/mL。DLS 以 ISO 标准品溶菌酶计为 0.1 mg/mL；抗体分子约大十倍，检测下限大概能低到几十 µg/mL。
• 00:32:42 · 00:33:52 · Q&A：Aunty 和 Uncle 相比 · Aunty 保留了 Uncle 把 SLS、DLS 和全光谱荧光结合的长处。它体积更小，数据采集快 5 倍，改用 96 孔板，去掉了液冷，配上新软件；仍可升温、降温，看热恢复。
• 00:33:52 · 00:35:02 · Q&A：小蛋白和多肽也能测 · 讲者团队用 15 kDa 的 VHH 测试效果很好，也有客户用来测多肽。没有芳香族残基的小蛋白可以改用报告染料，这正是全光谱荧光的灵活之处。
• 00:35:02 · 00:36:22 · Q&A：kD / B22 / G22 的浓度怎么设 · 浓度至少跨一个数量级，150 kDa 蛋白建议从 0.5–10 mg/mL 起步。要做 150 mg/mL 皮下注射制剂，就在那个浓度范围看胶体稳定性，进入 G22 的范畴。
• 00:36:22 · 00:38:03 · Q&A：等温测试怎么做 · 升温筛选、胶体稳定性之后就是等温测试。样品在板里密封，板有条码，可以拍一次快照后取出、在外面孵育，再放回去读，持续几小时到几天甚至更久。也可以直接在 Aunty 里跑。
• 00:38:03 · 00:38:20 · Q&A：单独做 DLS · 可以。Aunty 就是一台基于石英板的 DLS 仪器，96 个样品、每个 8 µL。
• 00:38:20 · 00:39:14 · Q&A：一次实验多长时间 · 整板 DLS 约每孔 20 秒。整板 Tm / Tagg 筛选按 1 °C/min 升温，常见设置约 80–90 分钟，2 °C/min 时时间减半。
• 00:39:14 · 00:40:08 · Q&A：自动化集成 · 不限集成商，各大厂商都合作过，很多 Aunty 已在自动化系统里运行。Unchained Labs 也有自家的自动化平台 Stuntman，可以把多台分析仪器串成可开发性评估流程。
• 00:40:08 · 00:41:19 · Q&A：升降温循环与自定义实验 · 升温和降温都是主动控温，可以做复性实验；Freeform 应用可以自己设计实验流程。
• 看懂一次升温里 BCM、SLS、DLS 三条曲线各给出什么：Tm、Tagg 和 Tsize
• 用板热图和部分因子设计，从 32 个条件里找出辅料和 pH 的主效应
• 理解为什么升温结果和 kD / B22 的结论会不同，两步怎样搭配
• 了解冻融测试怎样找出某个辅料对特定蛋白的影响