蛋白药物稳定性入门 · 第 2 篇
纯化后的蛋白药物大多是高纯度单体。但储存、运输和给药过程中，几乎所有蛋白药物都会慢慢形成不可逆的聚集体（Roberts 2014）。多数产品的目标货架期在两年或以上（Roberts 2014）。
分子变坏有物理和化学两类途径，而且互相推动：化学修饰会削弱构象稳定性，去折叠又会加速聚集（Manning 等 2010）。弄清是哪条途径，才能选对检测方法和配方对策。
早期筛选候选分子和配方，通常考察三个方面：构象、胶体和化学稳定性（Razinkov & Kleemann 2017，第 2 章）。
类别 / 分子发生什么 / 常用指标
构象稳定性:分子发生什么 部分或完全去折叠，疏水片段暴露;常用指标 Tm、Tonset、ΔG
胶体稳定性:分子发生什么 分子之间互相吸引，自缔合、聚集或析出;常用指标 B₂₂、kD、表观溶解度
化学稳定性:分子发生什么 共价结构改变：脱酰胺、异构化、氧化、片段化等;常用指标 电荷变异体、修饰位点和比例
三者相互关联，不能互相替代。同一个样品可能 Tm 很高，却因分子间吸引而聚集；也可能构象和胶体都好，却在储存中慢慢脱酰胺。
蛋白药物里最受关注的是非天然聚集（non-native aggregation）。常用 Lumry–Eyring 式的模型描述：先可逆地去折叠，再不可逆地聚集（Chi 等 2003）。
N ⇌ U → 聚集体N 为天然态，U 为部分或完全去折叠态；第二步通常不可逆
Roberts 总结了这类聚集的特点（Roberts 2014）：
免疫原性是聚集体受严格管控的主要原因。以高度阵列方式呈现的蛋白抗原能强烈交联 B 细胞受体。即使没有 T 细胞辅助，它也能诱导抗体（Rosenberg 2006）。
IgG 的热变性是一个直观的例子。去折叠之后紧接着发生不可逆聚集；温度更高时，聚集快到分子还没完全去折叠就被锁进聚集体（Vermeer & Norde 2000）。
所以提高构象稳定性通常能减慢聚集，但不是唯一手段。分子间相互作用同样决定聚集快慢。
图 1 · 蛋白分子变坏的几条途径。上排：天然态与去折叠态可逆转换，去折叠后形成多数情况下不可逆的非天然聚集体；天然态分子也可自缔合。下排：化学修饰改变共价结构，可能降低构象稳定性或增加聚集倾向。示意图。
不去折叠，分子之间也会互相吸引。这类问题归在胶体稳定性（colloidal stability）下面。
折叠态分子的自缔合，早期一般可逆。蛋白也可以在构象基本不变的情况下析出，比如盐析；这类沉淀稀释后或换条件后可能重新溶解（Roberts 2014）。
折叠态分子的析出往往在降温时加快，方向和非天然聚集相反（Roberts 2014）。所以冷藏样品出现浑浊，不一定是去折叠造成的。
分子间的静电排斥能阻止它们靠近。Roberts 汇总了多组单抗和模型蛋白的结果（Roberts 2014）。pH 离等电点越远、净电荷越大，离子强度越低，聚集体越不容易长大，反之亦然。
衡量分子间相互作用，常用第二维里系数（second virial coefficient，B₂₂）和扩散相互作用参数（diffusion interaction parameter，kD）。二者都从一组浓度梯度的光散射数据得到。大体上，数值为正表示分子间以排斥为主，为负表示以吸引为主。
Stunner 测 B₂₂ 和 kD 的做法见一组稀释系列，同时测出 B₂₂ 和 kD 两个聚集预警指标。高浓度制剂超出 B₂₂ 的适用范围时，改用 G₂₂，见这篇应用笔记。
另一种办法是 PEG 沉淀法：加入聚乙二醇诱导析出，测上清中剩余的蛋白。它不需要加热或振荡，能在接近储存的条件下比较配方的溶解度（Razinkov & Kleemann 2017，§2.1）。
“聚集体”这个词覆盖的范围很宽。Narhi 等建议从五个维度描述一种聚集体：尺寸、可逆性、构象、共价修饰和形态（Narhi 等 2012）。二聚体和肉眼可见的颗粒都叫聚集体，但形成机制、风险和检测方法差别很大。
尺寸从纳米级的寡聚体一直跨到肉眼可见。Mahler 等指出，没有任何一种分析方法能覆盖全部尺寸范围和聚集体类型（Mahler 等 2009）。
每种方法各有检测限，样品处理本身也可能制造或破坏聚集体。所以同一尺寸段最好用两种原理不同的方法相互印证。
图 2 · 聚集体按尺寸从可溶的寡聚体到可见颗粒，不同方法各管一段。各方法的覆盖区间只表示相对位置，具体上下限取决于仪器和样品。示意图。
常用方法各有侧重：
样品浑浊时，280–360 nm 的散射会叠加在吸收上。A280 因此读高，而溶液中的蛋白其实在减少（Razinkov & Kleemann 2017，§2.1）。散射怎样干扰 A280，见A280 读高了？可能是散射在干扰。
Hawe 等归纳了强制降解中常用的应力（Hawe 等 2012）。包括升温、冻融、机械应力（振荡、搅拌）、氧化和光照，以及给药时接触的材料和器具。
界面是容易被忽视的应力来源。生产和纯化中，蛋白会接触滤膜、层析填料、灌装管路，以及玻璃或塑料的西林瓶和注射器（Razinkov & Kleemann 2017，§2.1）。
蛋白与表面作用时，最常见、通常也不可逆的结果是构象改变。配方中的表面活性剂能改变这种作用（Razinkov & Kleemann 2017，§2.1）。
聚山梨酯 20 和 80 就是为此加入的：防止蛋白吸附到表面，并抑制聚集。但它们自身也会降解，包括自氧化和酯键水解；产生的过氧化物和短链酸可能影响产品稳定性（Kerwin 2008）。
稳定性考察的要求写在法规指南里，而强制降解除光稳定性外，基本没有标准方法（Hawe 等 2012）。条件怎样选、各条件主要引发哪种降解，可参考单抗强制降解实践指南（Nowak 等 2017）。
常见的化学降解有氧化、脱酰胺、水解、异构化、β-消除和二硫键交换（Razinkov & Kleemann 2017，§2.3）。很多修饰能从序列上预判：先找出反应活性高的“热点”残基。
序列只是一半。同样的天冬酰胺，在核糖核酸酶 A 的折叠结构里脱酰胺最慢，在序列相近的短肽里快得多。侧链活动受限、与邻近残基相互作用，都会减慢反应（Razinkov & Kleemann 2017，§2.3）。
天冬酰胺（Asn）的侧链先环化成琥珀酰亚胺中间体，再水解成天冬氨酸（Asp）和异天冬氨酸（isoAsp）的混合物，同时伴随消旋。
Geiger 和 Clarke 的模型肽 Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala，在 37 °C、pH 7.4 下脱酰胺半衰期只有 1.4 天。把 Asn 后面的甘氨酸换成亮氨酸或脯氨酸，降解慢 33–50 倍（Geiger & Clarke 1987）。所以 -Asn-Gly- 是重点排查的序列。
天冬氨酸也能经同一中间体异构化，只是成环比 Asn 慢 34 倍（Geiger & Clarke 1987）。
单抗互补决定区（CDR）里的 Asp 异构化常被列为关键质量属性。Dick 等发现，重链异构化后亲和力下降：结合变慢，解离变快。异构化速率随 pH 变化，也受缓冲液组分影响（Razinkov & Kleemann 2017，§2.3）。
图 3 · 天冬酰胺脱酰胺经琥珀酰亚胺中间体，水解生成异天冬氨酸和天冬氨酸，侧链酰胺变成羧基，多一个负电荷。下方数据取自 Geiger 和 Clarke 1987 年的模型肽实验。示意图。
最容易氧化的残基是甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸。诱因包括混入的氧化剂、过渡金属离子和光照；pH、温度和缓冲液组成也有影响（Li 等 1995）。
对策要看机理。由氧化剂引起的氧化，加抗氧化剂或自由基清除剂有效。金属催化的氧化是位点特异的，加抗氧化剂反而可能加速反应，可改为筛选螯合剂（Li 等 1995）。
2–8 °C 下的化学降解很慢。常见做法是在较高温度下测速率常数，再用 Arrhenius 方程外推到储存温度：k = A·exp(−Ea / RT)。
外推有前提。要先弄清反应级数；高温下的构象变化、低温下的天然自缔合，都会让结果偏离 Arrhenius 行为。不同降解途径的活化能不同，4 °C 和 37 °C 下的产物种类和比例可能差别很大（Razinkov & Kleemann 2017，§2.3）。
先想清楚要回答什么问题，再选方法：
要回答的问题 / 常用方法 / 读出
构象变了没有:常用方法 差示扫描荧光（内源或染料）、DSC、CD;读出 Tm、Tonset、二级结构
有没有可溶性聚集体:常用方法 SEC、DLS、SLS;读出 单体比例、粒径与多分散性、Tagg
有没有亚可见或可见颗粒:常用方法 光阻法、流式成像、目视检查;读出 颗粒数量、尺寸和形态
分子间是吸引还是排斥:常用方法 稀释系列的 SLS / DLS、PEG 沉淀;读出 B₂₂、kD、表观溶解度
共价结构变了没有:常用方法 离子交换色谱、毛细管电泳、反相色谱、质谱肽图;读出 电荷变异体、片段、修饰位点
浓度有没有下降:常用方法 A280;读出 蛋白浓度；浑浊样品要考虑散射
方法归类综合 Mahler 等 2009 与 Razinkov & Kleemann 2017 第 2 章。
电荷类方法有盲区。Asp 异构化和二硫键错配不改变电荷，离子交换色谱看不出来，需要用质谱确认（Razinkov & Kleemann 2017，§2.3）。化学修饰的定性和定位，要靠色谱、电泳和质谱。
早期筛选样品多、蛋白少，能在小体积里同时读几个指标的方法更实用。Aunty 在一轮升温中同时读出荧光 Tm、SLS 的 Tagg 和 DLS 粒径。它也能在固定温度下连续监测，或把板放在仪器外孵育、定期上机读数。
Stunner 用 2 µL 样品同时测 UV/Vis 浓度和 DLS 粒径。做法见2 µL 样品同时判断蛋白浓度与聚集状态。