蛋白药物稳定性入门 · 第 1 篇
制剂和分析岗位天天谈“稳定性”。对蛋白药物来说，它的第一层意思是：分子能不能保持天然构象。
天然构象由氨基酸序列决定，靠一组弱相互作用维持。这些作用力加起来的净值不大，所以温度、pH、盐和辅料都能改变它。Tm 和 ΔG 是描述这种稳定性的两个常用量，各有适用范围。
蛋白质由 20 种标准氨基酸经肽键连接而成，排列顺序由基因编码。这条链在水中会自发折叠成特定的三维形状，即天然构象（native conformation）。
Anfinsen 用核糖核酸酶 A 做过一组经典实验。先用变性剂打开结构、还原二硫键，酶完全失活。再除去变性剂、让二硫键重新氧化，酶恢复了天然结构和活性。
这组实验支持他的热力学假说：在生理条件下，天然构象是整个体系自由能最低的状态，信息全在序列里（Anfinsen 1973）。
一条链可能的构象数目极大，逐个试一遍不可能。Dobson 把折叠描述为有偏向的随机搜索（Dobson 2001）。天然的残基间相互作用平均比非天然的更稳定，所以链能很快找到天然态。
对药物而言，正确折叠意味着正确的功能。去折叠或部分去折叠的分子更容易聚集（Roberts 2014）。聚集是本系列第 2 篇的主题。
蛋白结构通常分成四个层级描述。
层级 / 是什么 / 主要靠什么维持
一级结构:是什么 氨基酸的排列顺序;主要靠什么维持 肽键（共价键）
二级结构:是什么 局部的规则构象：α 螺旋、β 折叠；以及没有重复规律的环区和转角;主要靠什么维持 主链 C=O 与 N–H 之间的氢键
三级结构:是什么 整条链折叠成的紧凑三维结构;主要靠什么维持 疏水作用、氢键、静电作用、范德华力；二硫键
四级结构:是什么 多条链组装成的复合体，如血红蛋白、IgG;主要靠什么维持 同三级结构；部分蛋白（如 IgG）另有链间二硫键
α 螺旋中，第 i 个残基的 C=O 与第 i+4 个残基的 N–H 形成氢键，主链因此盘成螺旋（Pauling 等 1951）。β 折叠由相邻的伸展链段并排组成，链段之间同样靠主链氢键连接。
环区和转角没有重复结构，多位于分子表面。三级结构里，疏水侧链大多埋在内部，亲水侧链朝向溶液。
去折叠会把原本埋在内部的疏水残基暴露出来。外源染料靠结合这些残基检测去折叠，聚集也常从这一步开始。
图 1 · 蛋白质结构的四个层级。一级结构是序列；β 折叠中的虚线为主链氢键；三级结构中疏水残基（橙）朝内、亲水残基（蓝）朝外，二硫键锁住构象；四级结构是多条链的组装。示意图，未按比例。
除二硫键外，维持三级结构的都是非共价作用：
折叠也有代价。一条链从大量构象收拢到一个构象，构象熵大幅减少。有利项和不利项相加，净值不大，所以折叠态只是“勉强稳定”（Roberts 2014）。
净值小，意味着溶液条件稍有变化就能改变它。He 等用差示扫描荧光法（differential scanning fluorimetry，DSF）筛选了 4 个单抗在 84 种配方中的热稳定性（He 等 2010）。
结果显示，盐总体上降低稳定性，低 pH 下更明显；蔗糖和山梨醇提高稳定性；脯氨酸和甘氨酸影响很小；精氨酸的作用随 pH 和分子而变（Razinkov & Kleemann 2017，§2.1）。配方筛选调的就是这些作用力。
最简单的描述是两态模型：分子只在天然态 N 和去折叠态 U 之间转换，二者处于平衡。
N ⇌ UK = [U] / [N]ΔG = GU − GN = −RT ln KΔG 为去折叠自由能；R 为气体常数，T 为绝对温度
ΔG 大于零，天然态占优；ΔG 越大，任一时刻处于去折叠态的分子越少。ΔG 等于零时，两种状态各占一半。
ΔG 随温度变化，画出来是一条有最高点的弯曲曲线，称为稳定性曲线（Becktel & Schellman 1987）。高温端曲线降到零的温度就是 Tm，对应热变性；低温端降到零的温度 Tc 对应冷变性。
另一种测 ΔG 的办法是化学变性：逐步加入尿素或盐酸胍，记录去折叠分数。ΔG 随变性剂浓度近似线性下降，外推到零浓度，得到缓冲液中的 ΔG。
这条直线的斜率叫 m 值。Myers 等汇总了一批蛋白的数据，发现 m 值与去折叠时新暴露的表面积高度相关（Myers 等 1995）。
化学变性在恒定温度下进行，不受高温不可逆聚集的影响，更容易得到热力学参数。化学变性的结果与加速条件下的聚集倾向总体相关。这一方法可用于筛选多个抗体配方（Razinkov & Kleemann 2017，§2.1）。
图 2 · 左：升温时去折叠分数从 0 升到 1，中点即 Tm。右：ΔG 随温度的稳定性曲线，在 Tm 处降到零，低温端的 Tc 对应冷变性。示意图，按可逆两态模型绘制，坐标无刻度。
升温时，去折叠分子的比例逐渐升高。比例达到一半时的温度，就是熔解温度（melting temperature，Tm）。在可逆两态模型中，Tm 正是 ΔG 等于零的温度。
不同方法看到的是去折叠的不同侧面：
不同方法的结果相关但不完全相同。在 He 等的研究中，染料法 Th 与 DSC 的 Tm 线性相关，R² 为 0.9605；染料信号的起点略早于 DSC 信号（Razinkov & Kleemann 2017，§2.1）。所以报告 Tm 时要写明测法。
第一，很多蛋白的去折叠不可逆。IgG 升温去折叠后，紧接着发生不可逆聚集（Vermeer & Norde 2000）。Sanchez-Ruiz 分析过这类模型（Sanchez-Ruiz 1992）。不可逆步骤主导转变时，曲线里提取不出平衡热力学信息。
这时测得的 Tm 只是表观值。比较不同样品时，升温速率、浓度等条件要保持一致。
第二，Tm 描述的是高温端。药品储存在 2–8 °C，决定货架期的是储存温度附近的行为。从稳定性曲线看，低温下的 ΔG 还取决于曲线形状，Tm 相近的两个样品，低温下未必一样稳定。
Tm 分不开的配方，可以改用等温实验比较，参见Tm 相近的配方，用等温实验分出稳定性高低。
第三，构象稳定不等于不聚集。折叠完好的分子之间也可能互相吸引、缔合。这属于胶体稳定性，第 2 篇再讲。
Aunty 在一轮升温中同时读构象和聚集两类信号：全光谱荧光给出 Tm，静态光散射给出聚集起始温度 Tagg。内源荧光用 280 nm 激发；芳香残基少、内源荧光信号弱时，可改用 470 nm 激发的外源染料。各参数的含义见Aunty 稳定性应用指南。
单抗是最常见的蛋白药物。IgG 由两条相同的重链（约 50 kDa）和两条相同的轻链（约 25 kDa）组成，链间以二硫键相连（Vidarsson 等 2014）。
每条重链有一个可变结构域 VH 和三个恒定结构域 CH1、CH2、CH3，CH1 与 CH2 之间是铰链区。每条轻链有 VL 和 CL 两个结构域。全分子共 12 个结构域。
两个 Fab 臂负责结合抗原，序列差异主要在可变区。Fc 区介导效应功能。每条重链的 Fc 区有一个 N297 糖基化位点。糖链约占分子总质量的 3%，却影响药效、药代动力学、稳定性和免疫原性（Razinkov & Kleemann 2017，§2.3）。
图 3 · IgG 的 12 个结构域。深色为重链（VH、CH1、CH2、CH3），浅色为轻链（VL、CL）；黄线为链间二硫键，蓝色符号为 Fc 区的 N297 糖链。示意图，未按比例。
结构域各自折叠，升温时也分步去折叠。中性 pH 下，IgG 的 DSC 曲线通常有两个峰，有时有三个（Ionescu 等 2008）。
峰和结构域怎么对应，取决于 Fab 相对 CH3 的稳定性。Ionescu 等比较了三个人源化 IgG1：Fab 不如 CH3 稳定时，第一个峰是 Fab 加 CH2，第二个峰是 CH3。反之，第一个峰是 CH2，第二个峰是 Fab 加 CH3。
即使出自同一胚系基因，不同 Fab 的表观 Tm 也相差明显（Ionescu 等 2008）。人源化时引入的可变区序列，能明显改变 Fab 的稳定性。
结构域对 pH 的敏感度也不同。He 等的 4 个单抗中，Th 随 pH 升高而升高，到 pH 6.5 附近后基本不再变化。一种解释是：pH 升到 6.5 以上后，CH2 的去折叠温度升高，与对 pH 不敏感的 Fab 重叠（Razinkov & Kleemann 2017，§2.1）。
外源染料法通常只能清楚读出最不稳定结构域的转变。后面几个转变的信号相互重叠（Razinkov & Kleemann 2017，§2.1）。所以染料法给出的单个 Tm，多半对应 Tm1 或起始温度，报告时要说明取的是哪一个。
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