膜蛋白离开细胞膜后稳定性差，去折叠时内源荧光又常常没有明显变化，热稳定性因此难以测定。本文以 GPRC5D 和 CD20 两个靶点蛋白为例，比较去垢剂、纳米盘（nanodisc）和病毒样颗粒（VLP）三种形式。同一次升温中同时采集 CPM 染料荧光、内源荧光和 SLS，升温前后再用 DLS 测粒径。纳米盘使两个蛋白的 CPM Tm 均升高；VLP 加热后粒径变小，整体结构发生了变化。
本文数据在上一代 Uncle 上采集，Aunty 沿用同样的全光谱荧光、SLS 和 DLS 检测。
GPRC5D 是多发性骨髓瘤的生物标志物，也是在研的免疫治疗靶点。CD20 是 B 细胞表面抗原，也是利妥昔单抗（rituximab）的靶点。缓冲液见 Table 1。GPRC5D 样品调至约 0.15 mg/mL，CD20 约 0.25 mg/mL。
样品:缓冲液
GPRC5D 去垢剂:50 mM HEPES、150 mM NaCl、0.05% DDM、0.01% CHS、10% 甘油，pH 7.5
CD20 去垢剂
GPRC5D 纳米盘:50 mM HEPES、150 mM NaCl、20% 甘油，pH 7.5
CD20 纳米盘:20 mM HEPES、150 mM NaCl、10% 海藻糖，pH 7.5
GPRC5D VLP:PBS、10% 海藻糖，pH 7.4
CD20 VLP
VLP 对照
Table 1. 7 个样品的缓冲液。DDM：十二烷基麦芽糖苷；CHS：胆固醇半琥珀酸酯。
CPM 加样：CPM（Thermo Fisher Scientific）用 DMSO 溶解至 5 mg/mL，分装后 -80 °C 保存。临用前取一管室温解冻，用对应样品的缓冲液稀释至 0.2 mg/mL。CPM 与蛋白的摩尔比按蛋白中非二硫键半胱氨酸的数目确定：GPRC5D 为 17:1，CD20 为 3:1。
热升温：每个样品三复孔，从 15 °C 升至 95 °C，速率 0.6 °C/min。不含 CPM 的样品用 266 nm 和 473 nm 激光同时激发，含 CPM 的样品只用 266 nm 激发。荧光和 SLS 同步采集。
数据分析：不含 CPM 的样品，Tm 取 300–430 nm 内源荧光的 BCM（重心波长）。含 CPM 的样品，Tm 取 400–525 nm 染料荧光的上升。Tm 为三复孔平均值，图中以竖线标出。升温前后各用 DLS 测一次平均流体动力学直径，每次 4 × 5 秒。
可溶蛋白去折叠时，内源荧光减弱，发射峰从约 330 nm 移至 350 nm；发生聚集时，SLS 随之升高（Figure 2A）。膜蛋白则不同：它所处的环境本身部分亲脂，去折叠时内源荧光往往观察不到这种位移。
CPM 提供了另一种信号。CPM（7-二乙氨基-3-[4-(碘乙酰胺基)苯基]-4-甲基香豆素）与游离巯基结合后，400–600 nm 的发射增强（Figure 2B）。蛋白去折叠后，原本埋藏的半胱氨酸暴露出来，CPM 信号随之上升。全光谱一次采集内源荧光和 CPM 荧光两个波段，两种 Tm 可以相互印证。染料荧光的分析方法以及 CPM 在模型蛋白上的验证，见《内源荧光不够用时，用全光谱荧光加染料测热稳定性》。
Figure 2. A：折叠态（绿）和去折叠态（蓝）蛋白的荧光光谱。去折叠后内源荧光减弱并红移，266 nm 处为 SLS 信号。B：结合半胱氨酸的 CPM（绿）和未结合的 CPM（蓝）的发射光谱。
去垢剂中的 GPRC5D，CPM Tm 为 46.2 °C，内源荧光 Tm 为 48.8 °C（Figure 3A）。两种信号反映的是蛋白中不同的部分，甚至可能对应不同的结构域，因此两者相差 2.6 °C。
嵌入纳米盘后，CPM Tm 升至 56.6 °C（Figure 3B）。纳米盘的骨架蛋白 MSP1D1 不含半胱氨酸，因此这条 CPM 曲线只反映 GPRC5D。但 MSP1D1 含芳香族残基，其荧光叠加到内源荧光中，使内源荧光无法给出 Tm。CPM Tm 升高 10 °C 以上，说明纳米盘很可能提高了 GPRC5D 的稳定性。
Figure 3. GPRC5D 在去垢剂（A）和纳米盘（B）中的 CPM 荧光（绿，左轴）和内源荧光 BCM（蓝，右轴）。竖线为 Tm。B 中只标出 CPM Tm，内源荧光无法给出 Tm。三复孔的代表性曲线。
CD20 的游离半胱氨酸只有 3 个，GPRC5D 有 17 个。位置也不同：CD20 的均位于胞质区或胞外区，GPRC5D 的跨膜 α 螺旋中也有分布。CD20 出现两个 CPM Tm，可能与这种分布有关。
去垢剂中的 CD20 有两个 CPM Tm：43.2 °C 和 50.9 °C（Figure 4A）。内源荧光随温度有变化，但无法给出 Tm。
嵌入纳米盘后，两个 Tm 分别为 44.2 °C 和 51.9 °C（Figure 4B），各升高约 1 °C。升幅小于 GPRC5D，方向一致，纳米盘可能同样提高了 CD20 的稳定性。此时内源荧光还给出一个 82.4 °C 的 Tm。GPRC5D 的纳米盘样品没有这一转变，因此它来自 CD20，而非骨架蛋白。
Figure 4. CD20 在去垢剂（A）和纳米盘（B）中的 CPM 荧光（绿，左轴）和内源荧光 BCM（蓝，右轴）。绿色竖线为 CPM Tm，B 中蓝色竖线为内源荧光 Tm。三复孔的代表性曲线。
VLP 的包膜来自细胞膜脂双层，适合承载膜蛋白。难点在于病毒自身蛋白的内源荧光会掩盖膜蛋白的信号，CPM 荧光也存在同样的问题。本例设有同型对照 VLP，可以将三组数据并列比较，尝试把各个转变归属到具体样品。
对照 VLP 有 3 个 Tm：37.9、48.5 和 59 °C。GPRC5D VLP 有 2 个：40.7 和 59.6 °C。CD20 VLP 也有 2 个：46.4 和 56 °C（Figure 5）。三者共有的最高转变，可能来自同一个病毒蛋白。
要把每个转变归属到具体蛋白，还需要更多实验。但从整体比较已能看出差别：GPRC5D VLP 比对照略稳定，CD20 也使 VLP 在较低温度下更不易去折叠。
Figure 5. GPRC5D VLP（绿）、CD20 VLP（蓝）和对照 VLP（黄）的内源荧光 BCM（300–430 nm）随温度变化，竖线为各自的 Tm。三复孔的代表性曲线。
样品 / CPM Tm（°C） / 内源荧光 Tm（°C）
GPRC5D 去垢剂:CPM Tm（°C） 46.2;内源荧光 Tm（°C） 48.8
GPRC5D 纳米盘:CPM Tm（°C） 56.6;内源荧光 Tm（°C） 无法给出
CD20 去垢剂:CPM Tm（°C） 43.2、50.9;内源荧光 Tm（°C） 无法给出
CD20 纳米盘:CPM Tm（°C） 44.2、51.9;内源荧光 Tm（°C） 82.4
VLP 对照:CPM Tm（°C） —;内源荧光 Tm（°C） 37.9、48.5、59
GPRC5D VLP:CPM Tm（°C） —;内源荧光 Tm（°C） 40.7、59.6
CD20 VLP:CPM Tm（°C） —;内源荧光 Tm（°C） 46.4、56
Table 2. 7 个样品的 Tm 汇总，均为三复孔平均值。
除 Tm 外，还需要观察颗粒本身的变化。DLS 比较升温前后的粒径和分布，SLS 在升温全程跟踪颗粒质量。两种读数的含义见《Aunty 测的每个参数是什么意思？》。
去垢剂中的 GPRC5D，加热前后的流体动力学直径都在 100 nm 左右（Figure 6A）。样品中 DDM 浓度高于临界胶束浓度，这些 100 nm 的颗粒很可能是包裹 GPRC5D 的去垢剂胶束，而非蛋白本身。
两种 VLP 加热后粒径都减小：GPRC5D VLP 从 236 nm 降至 186 nm，CD20 VLP 从 158 nm 降至 136 nm。加热是灭活病毒的常用手段。结合 DLS 和内源荧光数据，VLP 在加热过程中很可能发生了较大的结构变化，其上的膜蛋白也可能受到影响。
颗粒质量增加（如蛋白聚集）时 SLS 升高，颗粒缩小或解体时 SLS 降低。去垢剂中 GPRC5D 的 SLS 在升温中保持稳定。CD20 VLP 的 SLS 从约 69 °C 开始下降，GPRC5D VLP 从约 58 °C 开始下降（Figure 6B）。这种下降反映的是 VLP 整体结构的变化，无法对应到某个具体蛋白。
Figure 6. A：去垢剂中的 GPRC5D（绿）、GPRC5D VLP（蓝）和 CD20 VLP（黄）加热前（浅色）和加热后（深色）的流体动力学直径。三复孔平均值，误差棒为 1 个标准差。B：266 nm SLS 强度随温度变化，以起始强度归一化，三复孔的代表性曲线。
过表达的膜蛋白本身稳定性差，去垢剂增溶会进一步降低其稳定性。内源荧光无法给出 Tm 时，可以改读 CPM 荧光；SLS 和 DLS 再从颗粒质量和粒径两方面跟踪变化。本例中，纳米盘使 GPRC5D 和 CD20 的 CPM Tm 均升高，VLP 加热后粒径减小、SLS 下降。把去折叠数据和粒径数据结合起来，才能全面了解加热对膜蛋白的影响，进而分析原因、制定对策。