升温实验能快速给出 Tm 和 Tagg，但几个配方的数值接近时，很难排出先后。等温实验把样品保持在略低于 Tm 的温度，持续数小时到数天，连续记录去折叠和聚集的过程。本文汇总两组实验。第一组是人 IgG 加不同浓度精氨酸，在 58 °C 保温 36 小时。第二组是一个单抗和 RNase A 加不同浓度 NaCl，在 60 °C 保温 16 小时，RNase A 另在培养箱中放置 3 天。
本文数据在上一代 Uncle 上采集，Aunty 沿用同样的全光谱荧光、SLS 和 DLS 检测。Aunty 的等温实验有两种做法：密封板留在仪器内，在设定温度下连续监测 1–2 天。也可以把板放在仪器外孵育，定期上机读数，实验可以持续很久，甚至几个月。
人 IgG 与精氨酸：人多克隆 IgG 购自 Lampire Biological Laboratories。缓冲液为 PBS，或含 25、50、100、250 mM 精氨酸的 PBS。升温实验用 5 mg/mL，每个样品 9 µL、两复孔，从 15 °C 升至 95 °C，速率 0.5 °C/min。Tm 取 350/330 nm 荧光比值的一阶导数，Tagg 取 266 nm 散射的起点。
等温实验用 1 mg/mL，三复孔，样品加入后立即密封，58 °C 保温 36 小时。荧光和 SLS 每 10 分钟采集一次全光谱。DLS 实验用同一批样品，同样 58 °C、36 小时，每 13 分钟采集一次，每次 4 × 5 秒；软件自动计算每个时间点的流体动力学直径。
单抗、RNase A 与 NaCl：单抗 1（mAb 1）母液从 26 mg/mL 稀释到 1 mg/mL。缓冲液为 25 mM His-HCl、pH 7.4，含 0、50 或 250 mM NaCl。RNase A（Sigma-Aldrich）冻干粉用水复溶至 10 mg/mL，分装后 −20 °C 冻存。临用时室温解冻，用同样三种缓冲液稀释到 1 mg/mL，再过 0.22 µm 滤膜。每个样品 9 µL，两复孔或三复孔。
升温实验从 15 °C 升至 95 °C，速率 1 °C/min。内源荧光 Tm 取 300–430 nm 荧光的 BCM（重心波长），Tagg 取 266 nm 散射。SYPRO Orange 实验中染料终浓度 10×，Tm 取 510–680 nm 荧光的面积，Tagg 取 473 nm 散射。等温实验在 60 °C 保温 16 小时，每分钟记录一次荧光和 SLS。板外孵育实验把样品放在 60 °C 培养箱中，每天上机测一次 DLS（4 × 5 秒），共 3 天。
上一代 Uncle 在 266 nm 和 473 nm 两个波长同时记录 SLS。散射强度与波长和聚集体大小都有关：266 nm 信号对小聚集体更灵敏，473 nm 信号主要反映较大的聚集体。
等温实验的温度由升温实验决定。人 IgG 在 PBS 中的 Tm 为 66.5 °C。精氨酸浓度越高，Tm 越低，Tagg 越高（Table 1）。已有研究表明，精氨酸能稳定蛋白的去折叠态，使 Tm 降低。为使所有配方的保温温度都低于各自的 Tm，等温实验选定 58 °C。
精氨酸是常用的配方辅料，能减少储存过程中的聚集。但它也可能与疏水残基相互作用，使部分蛋白去稳定。这组实验考察精氨酸浓度对同一个抗体去折叠和聚集的影响。
配方 / Tm（°C） / Tagg（°C）
PBS:Tm（°C） 66.5;Tagg（°C） 57
PBS + 25 mM 精氨酸:Tm（°C） 65.5;Tagg（°C） 61
PBS + 50 mM 精氨酸:Tm（°C） 64;Tagg（°C） 63.5
PBS + 100 mM 精氨酸:Tm（°C） 62;Tagg（°C） 65
PBS + 250 mM 精氨酸:Tm（°C） 59;Tagg（°C） 未检出
Table 1. 人 IgG 在 5 个配方中的 Tm 和 Tagg，为复孔平均值。250 mM 精氨酸中未观察到明显的聚集起点。
58 °C 保温 36 小时后，有无精氨酸的原始光谱差别明显（Figure 1）。PBS 中的样品在第一次读数时，266 nm 和 473 nm 处只有很小的散射峰，说明几乎没有聚集；同时有较强的荧光信号，主要来自色氨酸。36 小时后，两处散射峰都很大，折叠态蛋白的荧光明显减弱。
含 250 mM 精氨酸的样品，最后一次读数与第一次几乎相同，只有 266 nm 处的散射略有升高。它的初始荧光峰比 PBS 中略低，说明加入精氨酸后，蛋白的初始构象可能已有差别。
Figure 1. 人 IgG 在 58 °C 保温 36 小时的原始荧光和 SLS 光谱，只画第一次（蓝）和最后一次（红）读数。A：PBS。B：PBS + 250 mM 精氨酸。330 nm 附近的宽峰为内源荧光，266 nm 和 473 nm 处的尖峰为散射。
在 36 小时内连续跟踪 473 nm 散射，精氨酸浓度越高，散射强度越低（Figure 2）。含 250 mM 精氨酸的样品在整个保温期内测不到聚集。
PBS 中的样品在保温约 25 小时后散射达到最大，随后下降。此时大聚集体可能已开始从溶液中沉淀出来。到 36 小时，PBS 的散射已低于 25 mM 和 50 mM 精氨酸。只比较 0 小时和 36 小时两个时间点，不如连续监测区分得准。
Figure 2. 人 IgG 在 58 °C 保温 36 小时的 473 nm 散射强度。PBS（灰）在 25 小时附近达到峰值后下降；精氨酸浓度越高，曲线越低，250 mM 精氨酸的曲线接近水平。
内源荧光反映不同配方中蛋白的相对构象状态。所有配方的 350/330 nm 荧光比值都随时间逐渐升高，说明蛋白在持续去折叠（Figure 3）。精氨酸浓度越高，保温一开始的比值就越高，蛋白一开始就处于不同的状态。这与前人的结果一致：精氨酸会使部分蛋白轻度去稳定。
Figure 3. 人 IgG 在 58 °C 保温 36 小时的 350/330 nm 内源荧光比值。5 条曲线都随时间上升，PBS 在约 23 小时后略有回落。从上到下依次为 250、100、50、25 mM 精氨酸和 PBS。
DLS 从粒径角度给出同样的趋势，细节更多（Figure 4）。PBS 中的 IgG 平均直径从约 20 nm 增大到 250 nm 以上，增幅超过 10 倍。精氨酸浓度每提高一档，粒径增幅都更小；250 mM 精氨酸中，36 小时内平均粒径增大不到 2 倍。图中画出三复孔数据，三条曲线基本重合。
Figure 4. 人 IgG 在 58 °C 保温 36 小时的平均流体动力学直径，每个配方三复孔。从上到下依次为 PBS、25、50、100 和 250 mM 精氨酸。
精氨酸抑制聚集、同时促进去折叠，在升温实验中同样能看到，见《96 个样品同时升温，去折叠和聚集一次读出》。
mAb 1 在 0 和 50 mM NaCl 中的 Tm 几乎相同，分别为 70.4 °C 和 70.2 °C；250 mM NaCl 中降至 69.5 °C（Figure 5，Table 2）。只看去折叠，无盐和低盐配方分不出差别。
聚集数据把两者区分开。50 mM NaCl 中，266 nm 散射在 66.1 °C 就开始上升。250 mM NaCl 和无盐配方分别到 71.9 °C 和 73.1 °C 才出现相近程度的聚集。NaCl 对蛋白可能起稳定作用，也可能起去稳定作用，取决于浓度和蛋白本身。
Figure 5. mAb 1 升温实验的 BCM（实线，左轴）和 266 nm 散射（虚线，右轴）。缓冲液为 25 mM His-HCl、pH 7.4，含 0 mM（绿）、50 mM（蓝）、250 mM（黄）NaCl。实线箭头指 Tm，虚线箭头指 Tagg。
用 SYPRO Orange 测，mAb 1 出现两个转变（Table 2）。第二个转变与 473 nm 散射给出的 Tagg 很接近，说明它来自大聚集体的形成，而非去折叠。染料荧光单独看时，分不清信号升高来自去折叠还是聚集；同时读 SLS 才能区分。另外，SYPRO Orange 测得的 Tm 比内源荧光低 3–5 °C，染料本身可能改变了蛋白的行为。染料法的分析方法见《内源荧光不足时，用全光谱荧光加染料测热稳定性》。
NaCl / Tm（BCM） / Tagg（266 nm） / Tm1（SYPRO） / Tagg（473 nm） / Tm2（SYPRO）
0 mM:Tm（BCM） 70.4 °C;Tagg（266 nm） 73.1 °C;Tm1（SYPRO） 67.5 °C;Tagg（473 nm） 81.9 °C;Tm2（SYPRO） 82.4 °C
50 mM:Tm（BCM） 70.2 °C;Tagg（266 nm） 66.1 °C;Tm1（SYPRO） 66.2 °C;Tagg（473 nm） 80.2 °C;Tm2（SYPRO） 81.3 °C
250 mM:Tm（BCM） 69.5 °C;Tagg（266 nm） 71.9 °C;Tm1（SYPRO） 64.4 °C;Tagg（473 nm） 79.8 °C;Tm2（SYPRO） 81.0 °C
Table 2. mAb 1 在 25 mM His-HCl、pH 7.4 中的稳定性参数汇总。
等温实验选 60 °C，远低于上表所有参数。50 mM NaCl 配方在第 1 小时内，266 nm 散射就开始上升（Figure 6）。473 nm 散射上升得晚一些，但也只用了几个小时。无盐配方的聚集比两个含盐配方都推迟得多。
综合升温和等温两类实验，无盐配方在各种条件下都最稳定，50 mM NaCl 配方最不稳定。对这个单抗，升温结果与等温结果吻合，短时间实验对它有预测价值。
Figure 6. mAb 1 在 60 °C 等温实验中的 266 nm 散射（虚线，左轴）和 473 nm 散射（点线，右轴）。横轴只画前 6 小时。0 mM（绿）、50 mM（蓝）、250 mM（黄）NaCl。
RNase A 完全不含色氨酸，内源荧光极低，所以改用 SYPRO Orange 测 Tm。三种配方中，RNase A 都只有一个 Tm，都在 61 °C 左右；升温过程中 SLS 也没有升高，说明三种配方中都没有明显聚集。仅凭升温数据，无法给三种配方排序。
在 60 °C 保温 16 小时，用 SLS 监测聚集。0 和 50 mM NaCl 配方在约 10 小时后出现明显聚集，250 mM NaCl 配方的散射几乎不变（Figure 7）。高盐配方能在更长时间内保持稳定。
Figure 7. RNase A 在 60 °C 保温 16 小时的 266 nm 散射（三角为数据点），只画最后 5 小时。0 mM（绿）和 50 mM（蓝）NaCl 的散射持续上升，250 mM（黄）基本持平。
更长期的稳定性研究多依赖 HPLC、SEC 或质谱，方法复杂、耗时。板外孵育让仪器不必全程被一个实验占用：样品在培养箱中孵育，定期取出上机读数，仪器在间隔期间可以跑别的实验。
同样三种配方的 RNase A 在 60 °C 培养箱中放置 3 天，每天测一次 DLS（Figure 8）。250 mM NaCl 配方的流体动力学尺寸没有变化；另两种配方到第 2 天结束时，Z 均直径明显增大。这与上面等温实验的结论一致。
与 mAb 1 不同，RNase A 的升温实验分不出三种配方，必须靠等温实验才能判断配方对稳定性的影响。
Figure 8. RNase A 在仪器外 60 °C 孵育 3 天、每天测一次的 DLS Z 均直径。0 mM（绿）和 50 mM（蓝）NaCl 在第 2、3 天明显增大，250 mM（黄）始终持平。
升温实验 2 小时内给出 Tm 和聚集倾向，适合先排序。等温实验在固定温度下监测数小时到数天，适合比较 Tm 相近的配方，本文的 mAb 1 和 RNase A 都属于这种情况。短期筛选先淘汰一批配方，进入长期储存和药效研究的配方就少了，省时间也省样品。
等温数据怎样拟合衰减速率、各等温应用读哪些信号，见《Aunty 测的每个参数是什么意思？》。