多数生物药制剂的浓度高于 10 mg/mL。浓度升高后，短程分子间作用变得突出，聚集风险可能快速变化。kD 和 B22 适合评估稀溶液，高浓度下更适合用 Kirkwood-Buff 积分 G22。本文用两组稀释系列：α-糜蛋白酶原 20–80 mg/mL，阿达木单抗 14–100 mg/mL。由此演示怎样判断 B22 是否还成立，以及怎样读 G22。
三个参数的物理含义，以及 G22 为什么适合高浓度，见《读懂光散射结果：Z-ave、PDI、B₂₂、Tagg 各从哪段信号来》。稀释系列怎样配、怎样拟合 kD 和 B22，见《一组稀释系列，同时测出 B₂₂ 和 kD 两个聚集预警指标》。
原文给出一条判据。下式成立时 B22 有效，否则应改用 G22：
c × B22 × MW:< 0.05
c：蛋白浓度；MW：蛋白分子量
kD、B22 为正表示分子间净排斥，为负表示净吸引。G22 的正负含义相反：正值表示净吸引，负值表示净排斥。B22 或 G22 为零，表示分子间作用力净为中性。
本文数据在上一代 Uncle 上采集。Aunty 的 Colloidal stability 应用同样用 DLS 和 SLS 测这三个参数。kD 始终可得，加入缓冲液空白可得 B22，输入分子量后还可得 G22。
α-糜蛋白酶原：商品化的 α-糜蛋白酶原先在 10 mM 柠檬酸钠（pH 3.5）中透析 4 次、每次 1 L，除去多余的盐。之后用 PMSF 处理，抑制胰蛋白酶。随后配成 80 mg/mL，缓冲液为 5 mM 磷酸钠（pH 7）或 40 mM 醋酸钠（pH 5）。每种缓冲液分加与不加 300 mM NaCl，共 4 个配方。浓度用吸光度核定，再稀释出 7 个浓度，最低 20 mg/mL。
阿达木单抗：阿达木单抗（adalimumab，约 144 kDa）配成 100 mg/mL，使用其商业配方（pH 5.2）。浓度用吸光度核定，再稀释出 7 个浓度，最低 14 mg/mL。
测量与分析：先测甲苯的散射强度，校准仪器参数。每个样品 9 µL、三复孔，每次 4 × 5 秒 DLS 采集。软件由各样品的散射强度算出 R90/K，再结合蛋白的预期分子量（α-糜蛋白酶原约 25.7 kDa），算出每个浓度点的 G22。G22 随浓度变化，每个浓度点各有一个值。同一套数据既可按 G22 分析，也可转到 kD 和 B22 应用中分析，不需要额外做实验。
磷酸盐缓冲液中，无论加不加 NaCl，R90/K 都随浓度明显上升，表明 α-糜蛋白酶原分子间存在净吸引（Figure 1）。醋酸盐缓冲液的两个配方斜率也为正，但不加 NaCl 的配方上升较缓，分子间净吸引较小（Figure 2）。这些趋势与文献中 α-糜蛋白酶原在相同缓冲液中、随离子强度变化的散射结果一致。
Figure 1. 磷酸盐 pH 7 中，R90/K 随 α-糜蛋白酶原浓度（20–80 mg/mL）的变化。蓝：不加 NaCl；绿：加 NaCl。
Figure 2. 醋酸钠 pH 5 中，R90/K 随 α-糜蛋白酶原浓度（20–80 mg/mL）的变化。蓝：不加 NaCl；绿：加 NaCl。
在 50–80 mg/mL 的 4 个浓度点上，除醋酸盐无盐配方外，其余 3 个配方的 G22 都为正（Figure 3）。蛋白在这些条件下有自缔合倾向。G22 的大小反映相互作用的强弱。磷酸盐加 300 mM NaCl 配方的吸引作用特别弱。
醋酸盐无盐配方的 R90/K 只是小幅上升，G22 在最高的几个浓度点为负，分子间为净排斥。同样加 300 mM NaCl，两种缓冲液的变化方向相反。
Figure 3. α-糜蛋白酶原在 4 个配方中、50–80 mg/mL 各浓度点的 G22。深蓝：磷酸盐 pH 7 加 NaCl；浅蓝：磷酸盐 pH 7 不加 NaCl；深绿：醋酸盐 pH 5 加 NaCl；浅绿：醋酸盐 pH 5 不加 NaCl。浅绿柱在 4 个浓度点均为负值。三复孔平均值，误差棒为标准差。
Table 1 汇总同一次实验得到的三个参数。按上面的判据核对，磷酸盐的两个配方和醋酸盐加盐配方的 kD 和 B22 不成立，只能用 G22 判断。
配方 / G22（mL/g） / kD（mL/g） / B22（mol·mL/g²）
磷酸盐 pH 7:G22（mL/g） 10.97;kD（mL/g） 无效;B22（mol·mL/g²） 无效
磷酸盐 pH 7 + 300 mM NaCl:G22（mL/g） 1.58;kD（mL/g） 无效;B22（mol·mL/g²） 无效
醋酸盐 pH 5:G22（mL/g） −3.00;kD（mL/g） 0.17;B22（mol·mL/g²） 2.24 × 10−4
醋酸盐 pH 5 + 300 mM NaCl:G22（mL/g） 5.33;kD（mL/g） 无效;B22（mol·mL/g²） 无效
Table 1. α-糜蛋白酶原 4 个配方的胶体稳定性参数，来自同一次实验。G22 为 80 mg/mL 浓度点的三复孔平均值。「无效」表示按判据核对，该配方的 kD 和 B22 不成立。
阿达木单抗在其商业配方（pH 5.2）中，R90/K 随浓度上升，到高浓度段逐渐趋平（Figure 4）。最高浓度点的 G22 为负，表明在这个已优化的配方中，分子间为净排斥。
在这么高的浓度下，不宜使用 B22。按判据核对，这组浓度范围内算出的 B22 不成立。
Figure 4. 阿达木单抗 R90/K 随浓度的变化。内嵌表为同一次实验中 3 个浓度点的 G22。浓度（mg/mL）100 时 −4.90 ± 0.10，84 时 −4.85 ± 0.14，70 时 −4.82 ± 0.42。误差棒为三复孔标准差。
同一组稀释系列可以独立算出 kD、B22 和 G22，覆盖低浓度到高浓度。α-糜蛋白酶原在两种缓冲液中加盐，溶液行为方向相反；阿达木单抗在商业配方的高浓度下 G22 为负。工作流程中的多个阶段，都可以用这三个参数评估构建体或配方的胶体稳定性，挑出聚集风险最低的方案。
高浓度配方还需关注粘度，稳定性与粘度同时筛选的案例见《一轮配方筛选，同时比较稳定性与粘度》。