辅料筛选常用 DoE（实验设计）。难点在于每个配方都要同时评估构象稳定性、热聚集和胶体稳定性，而传统方法一次运行往往只给出一个读数。本例以三个单抗生物类似药和碳酸酐酶为对象，按 5 因素两水平的部分析因设计配成 8 个配方。Aunty 用一块板、1 小时 20 分钟测定 32 个样品的 Tm、Tonset、Tagg 和 Tsize，再用稀释系列测定 kD 和 B22。回归分析显示，精氨酸和 NaCl 推迟热聚集，却加强分子间吸引；PS80 的作用相反。
受试蛋白为阿达木单抗（adalimumab）、利妥昔单抗（rituximab）和曲妥珠单抗（trastuzumab）三个生物类似药，以及牛红细胞来源的碳酸酐酶 II。
三个单抗的起始配方见 Table 1，先用 10 mM 组氨酸/组氨酸盐酸盐（pH 5.5）稀释至 10 mg/mL。碳酸酐酶用去离子水溶解至 10 mg/mL。
蛋白 / 缓冲液 / pH / 辅料
50 mg/mL 阿达木单抗生物类似药:缓冲液 柠檬酸-磷酸盐;pH 5.2;辅料 6.2 mg/mL NaCl、12 mg/mL 甘露醇、1 mg/mL PS80
10 mg/mL 利妥昔单抗生物类似药:缓冲液 柠檬酸盐;pH 6.5;辅料 9 mg/mL NaCl、0.7 mg/mL PS80
20 mg/mL 曲妥珠单抗生物类似药:缓冲液 组氨酸;pH 6;辅料 19.09 mg/mL 海藻糖、0.09 mg/mL PS20
碳酸酐酶 II:缓冲液 冻干粉;pH —;辅料 —
Table 1. 三个单抗生物类似药和碳酸酐酶的起始配方
4 个蛋白均用 Unfilter 96 超滤换液板换入待测配方，此时不含 PS80。碳酸酐酶用 10 kDa 膜，单抗用 30 kDa 膜，参数采用 0.5–50 mg/mL 蛋白溶液的默认设置。换液后补加 PS80 或水，得到 Table 2 中的 8 个最终配方。换液前后的蛋白浓度均在 Stunner 上测定，四复孔，扣除缓冲液空白。
5 个因素为 pH、精氨酸、NaCl、蔗糖和 PS80，各取两个水平，组氨酸固定在 9.3 mM。设计采用分辨率 III 的部分析因：8 个配方即可估计 5 个主效应，代价是主效应会与两因素交互作用混杂。该设计的前提是交互作用远小于主效应。
配方 / pH / 精氨酸 mg/mL / NaCl mg/mL / 蔗糖 mg/mL / PS80 mg/mL
Table 2. 部分析因设计矩阵。8 个配方都含 9.3 mM 组氨酸。
热升温：32 个样品（4 个蛋白 × 8 个配方）均稀释至 2 mg/mL，每孔 8 µL，三复孔，正好排满一块 96 孔板。孔位按 DoE 惯例随机排布。使用 Tm & Tagg with sizing 应用从 15 °C 升至 95 °C，速率 1 °C/min，全程自动设置，耗时 1 小时 20 分钟。
Tm 取内源荧光（310–370 nm）光谱重心 BCM 一阶导数的峰值。Tonset（开始去折叠的温度）取 BCM 开始上升处。Tagg 取 SLS 强度开始上升处，Tsize 取 DLS z-均直径开始增大处。
胶体稳定性：每个配方配制 5 个浓度的稀释系列，每孔 8 µL，三复孔。使用 Colloidal stability 应用在 25 °C 测定，扣除缓冲液空白，DLS 每次采集 5 × 4 秒，自动衰减。
一块板 96 个孔，每孔 4 个温度指标，数据量大，需要借助可视化来解读。Aunty 软件将结果绘制成板图热图，颜色从黄到紫表示温度从低到高。
Tm 热图（Figure 2A）中，碳酸酐酶三列整体偏黄，熔解温度低于三个单抗。利妥昔单抗和曲妥珠单抗在配方 1 中 Tm 偏低，曲妥珠单抗在配方 6 和配方 7 中 Tm 偏高。
Tagg 热图（Figure 2B）中，碳酸酐酶的 Tagg 低于所有单抗，且常常低于其自身的 Tm，说明它受热时极易聚集。曲妥珠单抗的 Tagg 跨度最大，配方 3 中约 63 °C，配方 6 中约 77 °C。
Figure 2. 3 个单抗生物类似药和碳酸酐酶在 8 个配方中的 Tm 热图（A，黄 57 °C 至紫 71 °C）和 Tagg 热图（B，黄 40 °C 至紫 78 °C）。三复孔，孔位随机。
去折叠与聚集相关，但聚集可以从天然态、降解态、部分去折叠态或完全去折叠态开始。因此，稳定构象的配方偶尔也会促进聚集。
曲妥珠单抗在配方 7 中的 Tm 高于配方 1，Tagg 却更低（Figure 3）；流体动力学直径也在更低的温度开始增大。配方 7 提高了曲妥珠单抗的构象稳定性，同时降低了其胶体稳定性。荧光、SLS 和 DLS 在同一次升温中读出，可直接观察到这种此消彼长。
Figure 3. 曲妥珠单抗生物类似药在配方 1（绿）和配方 7（蓝）中。A：内源荧光 310–370 nm 的 BCM（实线）及其导数（虚线），竖线为 Tm。B：SLS 强度（左轴，实线）、流体动力学直径（右轴，虚线），竖线为 Tagg。三复孔的代表性曲线。
天然态下的聚集倾向在很大程度上取决于辅料和 pH。kD（扩散相互作用参数）和 B22（第二维里系数）常用于找出聚集风险高、可开发性差的配方。Colloidal stability 应用用 DLS 测定稀释系列的扩散系数，由斜率计算 kD；同时根据 SLS 强度随浓度的变化计算 B22。负值表示分子间相互吸引，聚集倾向高；正值表示相互排斥，稳定性更好。
4 个蛋白的 8 个配方均测定了 kD 和 B22，这里以利妥昔单抗为例。利妥昔单抗只在配方 3 和配方 7 中 kD 和 B22 均明显为正（Figure 4），其余配方为负或接近 0。这两个配方中分子间排斥力强，天然态聚集风险低。对照 Table 2，配方 3 和配方 7 都含 PS80，且都不含精氨酸和 NaCl。
Figure 4. 利妥昔单抗生物类似药在配方 1–8 中的平均扩散系数随浓度变化（A）和 Debye 图（B），带线性回归。
改善一个稳定性指标，常常要以牺牲另一个为代价。将 Aunty 导出的数据按 DoE 做回归分析，即可看出哪些因素显著影响构象稳定性（Tm/Tonset）、热聚集（Tagg/Tsize）和胶体稳定性（kD/B22），见 Table 3。
蛋白 / Tm/Tonset / Tagg/Tsize / kD/B22
升高:Tm/Tonset 降低;Tagg/Tsize 升高;kD/B22 降低;升高;降低
阿达木单抗:Tm/Tonset pH 7;Tagg/Tsize NaCl 蔗糖;kD/B22 精氨酸 NaCl;PS80;PS80;精氨酸
利妥昔单抗:Tm/Tonset pH 7 PS80;Tagg/Tsize NaCl 蔗糖 精氨酸;kD/B22 精氨酸 NaCl;PS80;PS80;精氨酸 NaCl
曲妥珠单抗:Tm/Tonset pH 7 精氨酸;Tagg/Tsize 蔗糖 NaCl;kD/B22 精氨酸 NaCl;PS80;PS80;NaCl 精氨酸
碳酸酐酶:Tm/Tonset 精氨酸 pH 7;Tagg/Tsize 蔗糖 NaCl;kD/B22 精氨酸 pH 7;蔗糖;无显著因素
Table 3. 回归分析中显著升高或降低各稳定性指标的因素。同一格内按效应大小排序。
pH：三个单抗在 pH 7 下的 Tm 和 Tonset 都高于 pH 5.5。它们的等电点（pI）在 8.2–8.7 之间，pH 越低净正电荷越多，可能削弱分子内稳定性，熔解温度随之降低。碳酸酐酶的 pI 为 5.4，在 pH 7 下带净负电荷。分子间的静电排斥可能提高了它的热稳定性，Tm、Tonset 和 Tagg 都更高。pH 对单抗的 Tagg 和 Tsize 没有显著影响。
精氨酸、NaCl 和 PS80：精氨酸和 NaCl 升高了 Tagg 和 Tsize，却降低了 kD 和 B22。PS80 降低了 Tagg 和 Tsize，却提高了 kD 和 B22。这 4 个参数都和聚集有关，但对应的机制不同：Tagg 和 Tsize 反映受热引起的聚集，kD 和 B22 反映分子间作用力驱动的聚集。因此精氨酸和 NaCl 减少热聚集、加强分子间吸引，PS80 的作用方向相反。
蔗糖和 NaCl：两者都降低了所有蛋白的 Tm 和 Tonset。两者都用来调渗透压，蔗糖也是常用的蛋白稳定剂，但浓度过高时会使蛋白失稳，同时升高粘度、促进聚集。液体制剂中蔗糖一般用 50 mg/mL，约为本研究 93.3 mg/mL 的一半，这可能是蔗糖表现为失稳的原因。曲妥珠单抗的商业配方含 19.09 mg/mL 海藻糖，在几个参考配方中糖浓度最高，也说明糖浓度需要优化。还有一种可能：分辨率 III 设计中，两因素交互作用会被当作主效应，蔗糖的表观效应里可能混有交互作用。
这一轮筛出的方向，可以接着用更高分辨率的设计细化辅料浓度，也可以并入多目标的配方研究。同样的做法也适用于构建体评估、蛋白工程和抗体偶联物筛选。
生物药在生产过程中，或因储存、搬运不当，都可能经历反复冻融。冻融最常见的降解途径是聚集，也可能引起结构变化、影响去折叠。Aunty 用 nanoDSF 监测去折叠，用 SLS 和 DLS 监测聚集体的形成。
经过 3 次冻融，所有蛋白在 pH 7 下的 Tm 仍高于 pH 5.5（Table 4）。NaCl 和蔗糖降低了各蛋白的 Tm，精氨酸提高了曲妥珠单抗和碳酸酐酶的 Tm。精氨酸和 NaCl 升高 Tagg 和 Tsize，PS80 降低它们。冻融后的样品 DLS 没有测到明显聚集。这些结果和冻融前的辅料筛选一致。
蛋白 / Tm/Tonset / Tagg/Tsize
升高:Tm/Tonset 降低;Tagg/Tsize 升高;降低
阿达木单抗:Tm/Tonset pH 7;Tagg/Tsize NaCl;精氨酸 NaCl;PS80
利妥昔单抗:Tm/Tonset pH 7;Tagg/Tsize NaCl 蔗糖 PS80;精氨酸 NaCl;PS80
曲妥珠单抗:Tm/Tonset pH 7 精氨酸;Tagg/Tsize 蔗糖 NaCl;精氨酸 NaCl;PS80
碳酸酐酶:Tm/Tonset 精氨酸 pH 7;Tagg/Tsize 蔗糖 NaCl;精氨酸 pH 7;蔗糖
Table 4. 3 次冻融后，回归分析中显著升高或降低各稳定性指标的因素。同一格内按效应大小排序。
碳酸酐酶与单抗不同，反复冻融后聚集行为明显改变（Figure 5）。配方 2 和配方 6 原本 Tagg 较高，冻融后显著下降：配方 2 从 62.8 °C 降至 56.4 °C，配方 6 从 66.7 °C 降至 61.5 °C。两个配方唯一的共同成分是精氨酸。精氨酸总体上减少聚集，对碳酸酐酶却可能起到了冷冻敏化作用。配方 4 和配方 8 同样含精氨酸，但加入了 NaCl 和 PS80，这一效应得到缓解。
Figure 5. 碳酸酐酶在 8 个配方中冻融前（绿）和 3 次冻融后（蓝）的 Tagg。三复孔平均值，误差棒为 1 个标准差。
将配方 2、4、6 的 SLS 曲线并列比较（Figure 6）。配方 4 冻融前后的 SLS 曲线几乎不变。配方 2 和配方 6 冻融后 SLS 更早上升，说明聚集更早开始。配方 6 冻融后在高温段的 SLS 强度高得多，提示聚集体更大或更多。冻融后的三个样品在 65 °C 以上 SLS 信号都骤降，蛋白从溶液中沉淀时会出现这种情况。
碳酸酐酶在配方 2 和配方 6 中，反复冻融后受热聚集得更早、更严重。冻融前后各测一次，即可找出冻融后的失稳因素，再通过辅料和 pH 加以缓解。
Figure 6. 碳酸酐酶在配方 2（A）、4（B）、6（C）中冻融前（绿）和 3 次冻融后（蓝）的 SLS 强度随温度变化，竖线为 Tagg。三复孔的代表性曲线。
DoE、贝叶斯模型和 AI 工具都能帮助理解越来越复杂的配方，前提是有足够的高通量、多参数稳定性数据。Aunty 在同一个平台上用板式检测测构象稳定性和胶体稳定性，每孔只需 8 µL。本例中，一块板就给出 4 个蛋白在 8 个配方中的 Tm、Tonset、Tagg 和 Tsize，回归分析随即分出每种辅料的作用方向，配方决策可以更快、更有把握。