清洁验证要回答的问题是：设备上残留的蛋白药物是否已经失活。一次热升温可以给出 Tm、Tagg、初始 BCM、Z-均直径和 PDI 五个数值，合起来就是药物的稳定性指纹。200 mg/mL 的 mAb 1 经过 CIP 后，Tm 和 Tagg 均无法测出，Z-均直径从 10 nm 增至 500 nm 以上。指纹与活性参比不符，说明蛋白已不可逆变性。本文数据在上一代 Uncle 上采集，Aunty 沿用同样的全光谱荧光、SLS 和 DLS 检测。
FDA 要求 CIP（Clean-in-Place，在线清洗）必须经过验证，确保上一批次的活性残留不会带入下一批次。因此每次清洗后，都需要确认残留蛋白已完全变性。
验证需要提供两方面证据：一是清洗程序使残留药物失活并被清除；二是该过程可重复，每次都能恢复到预定的可接受水平。
常用的 SDS-PAGE、SEC-HPLC、免疫分析和 TOC（总有机碳）检测各有局限：可能出现假阳性，通量低，或需要专门的操作技能。
内源荧光直接反映蛋白是否处于折叠状态。活性蛋白升温时会发生去折叠，曲线上出现转变，可以读出 Tm；已变性的蛋白没有这一转变。SLS 和 DLS 再补充聚集和粒径信息。各参数的定义见 Aunty 测的每个参数是什么意思。
指纹实验：NIST 单抗标准品（RM 8671）用 25 mM 组氨酸（histidine，pH 6.0）配制至 0.5 mg/mL。CIP 实验用另一个单抗 mAb 1，配制至 200 mg/mL。每个样品 9 µL，三复孔。
用 Tm & Tagg 应用从 15 °C 升至 95 °C，速率 0.5 °C/min。升温前后各采一次 DLS，每次 4 × 5 秒。所有实验都用荧光强度的 BCM（barycentric mean，光谱重心）作分析方法。
模拟 CIP：Freeform 模式可以自定义温度曲线和各段时长。本例按 CIP 程序设定：从 25 °C 升至 80 °C，在 80 °C 保持，再降回 25 °C。全程分段采集荧光和 SLS，监测蛋白在 CIP 过程中的变化。
荧光、SLS 和 DLS 在一次实验中给出 5 个数值：Tm、Tagg、初始 BCM、Z-均直径和 PDI。这组数值描述药物的活性形式，即参比指纹。
以 NIST 单抗为例（Figure 2）：BCM 曲线上可读出三个去折叠转变，SLS 曲线上读出 Tagg，DLS 分别测定了天然态和热变性后的粒径分布。NISTmAb 在 Aunty 上的 Tm 与 DSC 的对照，见 Aunty 平台介绍。
药物经过 CIP 后，再做一次同样的实验。若数值与参比不符，说明药物的结构和活性已发生不可逆改变。
Figure 2. NIST 单抗的热升温实验。A：内源荧光 BCM（蓝，左轴）和 266 nm SLS 强度（绿，右轴），箭头标出 Tm1–Tm3 和 Tagg。B：天然态（蓝）和热变性后（黑）的 DLS 粒径分布。
先测 mAb 1 建立参比指纹，再测经过 CIP 的 mAb 1。CIP 结束、样品冷却后，mAb 1 已经去折叠并发生聚集（Table 1）。
mAb 1 / Tm / Tagg / 初始 BCM / Z-均直径 / PDI
CIP 前:Tm 70 °C;Tagg 71 °C;初始 BCM 339 nm;Z-均直径 10 nm;PDI 0.5
CIP 后:Tm 无（已变性）;Tagg 无（已聚集）;初始 BCM 高于参比;Z-均直径 >500 nm;PDI >2
Table 1. 用荧光、SLS 和 DLS 比较 mAb 1 在 CIP 前（参比）和 CIP 后的去折叠与聚集。
CIP 后的样品升温时没有去折叠转变，无法读出 Tm；样品已经聚集，SLS 上也找不到聚集起始点。初始 BCM 明显高于参比，说明升温开始前蛋白已处于去折叠状态。Z-均直径和 PDI 大幅升高，说明去折叠后又形成了大聚集体。
CIP 的可调参数包括温度、化学成分及浓度、接触时间和循环次数，目标都是使蛋白完全变性。Freeform 模式可以复现 CIP 程序的时间和温度，也可以固定时间和温度曲线，只优化变性剂浓度。
变性剂浓度越高，mAb 1 失活程度越高（Figure 3）。单独加热也能使蛋白变性，但只有加热配合化学变性剂，mAb 1 才完全、不可逆地去折叠。
降回 25 °C 后，未加变性剂的样品 BCM 回落，加变性剂的样品 BCM 保持在高位。据此可以确定变性剂的 MEC（minimum effective concentration，最低有效浓度），即完全变性所需的最低浓度。
Figure 3. 用 Freeform 模拟 mAb 1 的 CIP 程序，优化变性剂浓度。蓝线为不加变性剂的活性药物，绿线由浅到深为变性剂浓度递增，红色虚线为温度（右轴）。
日常验证即比较 CIP 后样品与活性药物的指纹（Figure 4）。定期对洗液做 QC 检测，可以证明其中蛋白的荧光特征与活性产品不同（Figure 4A）。同一检测也能确认工艺残留在规格范围内。
Figure 4A 中，活性药物升温时出现去折叠转变；CIP 后样品的 BCM 随温度持续上升，没有转变。Figure 4B 比较升温前后的 BCM：CIP 后样品的初始和终点 BCM 均高于参比，表明 mAb 1 已完全变性。
加变性剂的 CIP 之后，DLS 测得的粒径和多分散性也都升高，说明蛋白完全去折叠后又发生了聚集。
Figure 4. 热升温实验显示 CIP 让 mAb 1 完全变性。A：活性药物（蓝）和 CIP 后样品（绿）的荧光熔解曲线。B：CIP 前后药物的初始（蓝）和终点（灰）BCM。
GMP 环境要求电子记录完整、数据安全。需要合规记录时，Aunty 可以选配 21 CFR Part 11 合规包。