AAV 载体受热有两条降解路径：基因组释放与衣壳破坏。两者温度不同，用同一次升温就能分开读。感染性和透射电镜耗时数天，ELISA 与 qPCR 也要数小时。本文用一次热升温，同时得到基因组释放 Tm、衣壳蛋白去折叠 Tm、聚集温度和升温前后的粒径，样品 9 µL。数据在上一代 Uncle 上采集，Aunty 的 Capsid stability 应用沿用同样的检测。
基因组释放发生在较低温度，衣壳仍完整，DNA 先逸出到缓冲液中。加入 SYBR Gold 后，释出的 DNA 与染料结合、荧光升高，由此得到一个 Tm。
衣壳破坏发生在衣壳蛋白去折叠之后，颗粒失去结构完整性并解体。读衣壳蛋白的内源荧光即可跟踪，不必加染料。外源染料会结合蛋白的疏水区，改变去折叠和聚集行为，也与部分辅料不相容。
同一次实验还用 SLS 跟踪聚集，用 DLS 给出升温前后的粒径与分布。
样品：表达 CMV-GFP 的 AAV 载体（Virovek），用量在 5E11 至 1E14 vg/mL 之间。AAV9 的配方缓冲液为 PBS 加 0.001% Pluronic F68；AAV1 和 AAV2 在同一缓冲液中另加 100 mM 柠檬酸钠。考察辅料时，向配方缓冲液中加精氨酸至 300 mM。
染料与标准品：10,000× SYBR Gold（DMSO）先用 PBS（pH 7.4）稀释成 400× 工作液。DNA 标准品由 AAV 载体提取，用 Lunatic 以紫外吸收定量，再在含 20× SYBR Gold 的 PBS 中稀释至 0.1、2、8、16 ng/µL。
升温与采集：所有样品先 14,000 rpm 离心 30 秒去除大颗粒。每样 9 µL、三复孔，25–95 °C，升温速率 0.5 °C/min，DLS 每次采集 4 × 5 秒。基因组释放实验加 20× SYBR Gold、一组标准品和一孔空白缓冲液，染料用可见光激发，Tm 取 500–650 nm 荧光强度曲线下面积的变化；衣壳蛋白去折叠实验用紫外激发内源荧光，Tm 和 Tonset 取 300–430 nm 的重心波长（BCM）。
1E13 vg/mL 的 AAV9 升温时，SYBR Gold 荧光分三段变化。起始信号来自样品中原有的游离病毒 DNA 或残留宿主细胞 DNA；随温度升高，染料自身信号下降；约 50 °C 起 DNA 从衣壳释出并结合染料，荧光回升。软件由这段回升定出 Tm 约 57 °C。同一次实验的聚集温度明显更高，Tagg 约 75 °C。
在 5E11 至 1E13 vg/mL 范围内测同一批 AAV9，基因组释放 Tm 落在 57.2 至 57.8 °C 之间，浓度的影响很小。低浓度样品 DNA 更少，荧光强度相应更低。
1E13 vg/mL 的 AAV9 以内源荧光测得衣壳蛋白去折叠 Tm 为 78.6 °C，Tonset 为 74.2 °C。两路激发光源对应的 SLS 分别给出 74.5 °C 和 75.2 °C 的聚集温度，与 Tonset 接近，说明聚集由蛋白去折叠驱动。
同一支 AAV9 的衣壳去折叠 Tm 比基因组释放 Tm 高 20 °C 以上。热应力下基因组释放先发生，两条路径可能彼此独立。
升温前后各测一次 DLS，可以判断样品初始质量和聚集程度。5E12 vg/mL 的 AAV9 在 PBS 中初始为单分散，Z-均直径约 29 nm，符合未聚集 AAV 的预期；升温后明显聚集，Z-均直径远超 1000 nm。
Figure 1. 5E12 vg/mL AAV9 在 PBS 中升温前后的强度分布（左）与质量分布（右）。绿线：升温前（Initial DLS），单峰位于 10 nm 量级；蓝线：升温后（Final DLS），强度分布在 1000 nm 附近出现宽峰。横轴为水合直径，对数坐标。
三种血清型的衣壳蛋白去折叠 Tm，与文献中用 SYPRO Orange 做差示扫描荧光（DSF）测得的值接近。两组数据的样品浓度不同：文献为 1E14 vg/mL，本文为 5–10E12 vg/mL。
Figure 2. 左（A）：AAV1（灰）、AAV2（蓝）、AAV9（绿）以内源荧光测得的衣壳去折叠曲线，纵轴为 BCM，箭头指示各自 Tm。右（B）：同三种血清型的 Tm（°C），左列为文献用 SYPRO Orange 做 DSF 的值（Bennett），右列为本文内源荧光值。AAV1 83.5 / 83.2，AAV2 68.2 / 66.7，AAV9 77.0 / 78.6；浓度一行为 1E14 vg/mL 与 5–10E12 vg/mL。
基因组释放也分得开。AAV2 的 Tm 为 49.6 °C，AAV9 为 57.2 °C，排序与衣壳去折叠一致：AAV9 比 AAV2 更耐热。选载体或做衣壳突变优化时，这两个温度可以一起看。
Figure 3. 5E12 vg/mL AAV2（蓝线）与 1E12 vg/mL AAV9（绿线）在各自配方缓冲液中的基因组释放曲线，纵轴为荧光强度曲线下面积，箭头指示 Tm。AAV2 的上升段起点明显更靠左。
同一支 4E12 vg/mL 的 AAV9，分别在 PBS 和加 300 mM 精氨酸的 PBS 中测。内源荧光显示加精氨酸后衣壳蛋白去折叠温度降低；SYBR Gold 荧光显示基因组释放 Tm 降低约 12 °C，幅度大于精氨酸对蛋白去折叠的影响。
这个浓度的精氨酸对该载体的构象稳定性不利，影响集中在基因组释放这条路径上。换个辅料浓度或缓冲体系，结论需要重测。
Figure 4. 4E12 vg/mL AAV9 在 PBS（绿）与 PBS 加 300 mM 精氨酸（蓝）中的曲线，箭头指示 Tm。左：内源荧光的衣壳去折叠曲线，PBS 为 78.0 °C，加精氨酸为 71.6 °C。右：SYBR Gold 荧光的基因组释放曲线，PBS 为 58.2 °C，加精氨酸为 45.7 °C。
升温前的 DNA 来自残留宿主细胞 DNA 或储存期间释出的病毒 DNA。升温后的 DNA 对应颗粒破裂释放的量。两次 SYBR Gold 荧光都与 AAV9 滴度强相关，对照标准曲线即可换算成浓度。
把实测的最终 DNA 浓度与按厂商提供的基因组滴度和序列算出的预期值相比，可以判断衣壳是否已全部破裂。四个浓度点的实测值与预期值接近。
Figure 5. 四个 AAV9 浓度在 PBS 中的平均 DNA 浓度（ng/µL）：升温前、升温后，以及按包裹 DNA 算出的预期值。5 × 10¹¹：0.05 / 0.66 / 0.64；1 × 10¹²：0.95 / 1.28 / 1.28；5 × 10¹²：0.53 / 6.89 / 6.42；1 × 10¹³：1.21 / 13.18 / 12.83。
样品没有明显聚集时，DLS 可以快速核对 AAV 的颗粒数。颗粒强度（particle intensity）是对散射强度做校正后的指标，校正的目的是把线性范围拉到最大。它与浓度成线性，AAV9 的下限约 5E11 vg/mL。
用已知的 AAV 稀释系列建标准曲线，就能算未知样品的颗粒数。用一组验证样品核对，已知浓度与计算浓度的斜率接近 1，R² 大于 0.995。
Figure 6. 左（A）：AAV9 浓度与颗粒强度的标准曲线，R² = 0.99991，误差棒为重复测量的标准差。右（B）：验证样品的计算浓度对已知浓度，y = 1.017x − 0.137，R² = 0.9957。两图横轴单位均为 ×10¹¹ vg/mL。
同一台仪器、同一批 9 µL 样品，可以得到基因组释放 Tm、衣壳蛋白去折叠 Tm 与 Tonset、聚集温度、升温前后粒径，以及游离 DNA、包裹 DNA 和颗粒数。血清型筛选、配方与辅料比较、储存条件考察都可以用这组指标排序。
Aunty 其余应用的实测案例见《Aunty 能做什么？构象、聚集、粒径、胶体和衣壳稳定性实测》。AAV 的滴度和空满比用另一类方法测，见《2 µL、一分钟：AAV 衣壳滴度、空满比和聚集一次测出》。