A280 读数偏高

浓度比预期高,样品可能浑浊或缓冲液有吸收。

轻微散射被算进了吸收

蛋白在 320–350 nm 几乎不吸收,A330 大于零即有散射

1. 查看软件给出的散射校正后 A280
2. 手算时用 A280 − 1.929 × A330

出处:方法一:Pace 1995 的 330 nm 校正;Lunatic 和 Stunner 上的散射处理

样品里有颗粒或聚集体

大颗粒不符合 λ⁻⁴ 规律,1.929 因子会失效

1. 用 0.2 µm 滤膜过滤后重测
2. 或 14,000 g 离心 10 min,取上清测
3. 散射规律不明时改用二阶导数光谱

出处:方法三:物理过滤;怎么选:一张决策表

样品低浓度或珍贵,不宜过滤

低浓度蛋白过膜吸附可能损失 10–30%

1. 离心后再做 330 nm 校正

出处:怎么选:一张决策表

空白和样品的溶剂不同

Tris 等缓冲液在 UV 区自身有吸收

1. 用和样品相同的溶剂或缓冲液做空白

出处:缓冲液和溶剂也在紫外区吸收;化学污染改变真吸收

气泡或杂质散射光

气泡散射光,造成表观 A 偏高

1. 加样时防止气泡
2. 用离心去除颗粒

出处:物理杂质会散射光;要点回顾