用热变性 + 荧光检测来衡量蛋白稳定性，是配方筛选中最常见的做法。大多数时候，内源荧光（色氨酸 / 酪氨酸）就能给出清晰的 Tm。但有些蛋白用内源荧光测不准：RNase A 没有色氨酸；膜蛋白需要去垢剂或脂质体包裹，背景散射很强，内源荧光信号被淹没。
全光谱荧光平台采集 nm 的完整荧光光谱，所以可以在同一次升温中同时分析内源荧光和染料荧光。再加上 SLS（静态光散射）和 DLS（动态光散射）同步采集，一次实验就拿到 Tm、Tagg 和粒径。
常规 DSF 仪器的荧光检测有两种模式：要么测固定波长比值（如 350/330 nm），要么测一种染料的单通道信号。所以你在实验设计阶段就要做选择：用内源荧光还是用染料。
开头提到的 RNase A 和膜蛋白，都属于内源荧光测不准的情况。改用染料，又会引出新的问题：染料有没有影响蛋白本身的去折叠行为？
全光谱的做法是每个温度点都采集完整光谱，从 250 nm 一直扫到 nm。软件从同一张光谱里同时提取内源荧光区间（300–430 nm）和染料荧光区间（比如 SYPRO Orange 的 536–650 nm），分别做分析。因此实验设计时不必在两者之间二选一，也不用跑两次实验。
IgG 本身有色氨酸，内源荧光完全够用。这里加染料，是为了回答一个常见问题：加了染料之后，蛋白的去折叠行为有没有改变？染料本身会不会干扰聚集？全光谱在同一次实验中同时采集两种信号，可以直接比较。
用牛多克隆 IgG（2 mg/mL）做测试。一组加 40× SYPRO Orange，一组加等体积 DMSO 作对照。9 µL 上样，三次重复，25–95 °C 升温，速率 0.6 °C/min。
下图是 15 °C 和 67 °C 时的荧光全谱。没加染料时（图 A），光谱中只有内源荧光的尖峰和激光产生的散射信号；加了 SYPRO Orange 之后（图 B），在 590 nm 附近出现了明显的染料荧光峰，这是因为蛋白去折叠暴露出疏水表面，染料结合后荧光大幅升高。
图 1：牛 IgG 在 15 °C（蓝线）和 67 °C（红线）的荧光光谱。(A) DMSO 对照，仅见内源荧光；(B) 加入 40× SYPRO Orange 后，590 nm 附近出现染料荧光峰。
全光谱软件用 BCM（barycentric mean，重心波长）分析 300–430 nm 区间的内源荧光来表征蛋白去折叠。无论是否加了 SYPRO Orange，BCM 给出的 Tm 很接近（72 °C vs 73 °C），说明染料对去折叠 Tm 的影响很小。同时，软件还可以用 536–650 nm 的 SYPRO Orange 荧光面积来独立计算 Tm，得到 70 °C。
图 2：(A) BCM 分析（300–430 nm）得到的 IgG 熔解曲线。加 SYPRO Orange（蓝）与 DMSO 对照（绿）的 Tm 均在 72–73 °C，说明染料对 Tm 影响很小。(B) SYPRO Orange 荧光面积（536–650 nm）的熔解曲线，Tm = 70 °C。
去折叠温度相近，SLS 数据却显示两组在高温区出现了差异。在 SLS 266 信号上，加了 SYPRO Orange 的 IgG，聚集起始温度（Tagg 266）比对照组推迟了约 2.6 °C（64.4 °C vs 61.8 °C）。染料结合到暴露的疏水表面上，可能阻碍了蛋白分子间的疏水相互作用，从而延迟了小聚集体的形成。
图 3：IgG 的 SLS 266 曲线。加 SYPRO Orange（蓝）的 Tagg 266 = 64.4 °C，DMSO 对照（绿）的 Tagg 266 = 61.8 °C。染料延迟了小聚集体的形成。
这个结果要和 SYPRO Orange 荧光给出的 Tm 一起看：Tm = 70 °C，比 BCM 的 72–73 °C 偏低。SLS 结果和这个 Tm 合起来说明，SYPRO Orange 的荧光行为同时受到蛋白去折叠和 70 °C 前已经开始的聚集的双重影响。只看染料荧光会错过这层关系，结合 SLS 才能看出聚集对 Tm 读数的影响。
RNase A 是一个 124 氨基酸的单结构域蛋白，不含色氨酸。用内源荧光分析它的热稳定性几乎不可能，因为信号太弱、噪声太大。
ANS（8-苯胺基-1-萘磺酸）的工作原理和 SYPRO Orange 类似：与蛋白去折叠后暴露的疏水区域结合。未结合时，ANS 在 545 nm 有弱荧光；结合蛋白后，荧光增强且发射峰蓝移到 470 nm。这个荧光增强 + 蓝移的特征，让全光谱平台可以用 400–630 nm 区间的 BCM 来画出清晰的熔解曲线。
实验用 0.5 mg/mL RNase A + 80 µM ANS，分别在纯水、10 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7）和 100 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7）中测定。RNase A 的去折叠并非简单的两态过程，BCM 曲线呈现两个转变：Tm1 对应早期部分去折叠，Tm2 对应完全展开。磷酸盐浓度越高，两个 Tm 都越高：纯水中 Tm1 = 42.6 °C / Tm2 = 60.3 °C，10 mM 磷酸盐中 43.5 / 61.6 °C，100 mM 磷酸盐中 45.1 / 62.6 °C。这与文献中用其他方法得到的稳定性结果一致（Stelea 等，Protein Science 2001;10(5):970–8）。
图 4：(A) RNase A + 80 µM ANS 在纯水（绿）、10 mM 磷酸盐缓冲液（蓝）和 100 mM 磷酸盐缓冲液（灰）中的 BCM 熔解曲线（400–630 nm）。每条曲线均可见两个转变（Tm1 和 Tm2），虚线标示 Tm 位置。(B) 纯水条件下的 BCM 曲线（绿实线）、Tm（绿虚线）和一阶导数（红线），局部极小值对应 Tm。
缺少色氨酸、内源荧光信号微弱的蛋白，可以加 ANS 测热稳定性。全光谱采集在读 ANS 荧光的同时，也保留了残余的内源荧光信息。
膜蛋白的稳定性向来难测：纯化困难，脱离脂质双层就容易聚集；去垢剂和脂质体还会散光或吸光，明显干扰传统 DSF 依赖的荧光检测。
CPM（7-二乙氨基-3-[4-(碘乙酰胺基)苯基]-4-甲基香豆素）是一种巯基反应性荧光染料。蛋白去折叠时暴露自由半胱氨酸，CPM 与之反应后荧光增强。CPM-巯基偶联物的激发峰在约 384 nm，紫外激光可以激发它，去折叠时 400–650 nm 波段会出现明显的荧光增强。
这里用牛 β-乳球蛋白（BLG，β-lactoglobulin）作模型蛋白。它是牛奶中的主要乳清蛋白，含 1 个自由半胱氨酸和 2 个色氨酸，所以既可以用内源荧光，也可以用 CPM 荧光测定热稳定性；全光谱同时采集这两种信号。40 µM BLG + 80 µM CPM，对照组用等体积 DMSO。
图 5：0.8 mg/mL BLG 在 45 °C（蓝线）和 65 °C（红线）的荧光光谱。(A) DMSO 对照，仅见内源荧光变化；(B) 加入 80 µM CPM 后，400–650 nm 区间随温度升高出现显著的 CPM 荧光信号。
从全光谱可以看到两件事。第一，加了 CPM 的样品，内源荧光（~330 nm 处的色氨酸峰）强度比对照组低，这是因为 CPM-巯基偶联物在 384 nm 有吸收，部分吸收了色氨酸发出的荧光。第二，随温度从 45 °C 升到 65 °C，400–650 nm 区间的 CPM 荧光明显增强，反映了去折叠过程中自由半胱氨酸的暴露。
用内源荧光和 CPM 荧光两种方法分析，BLG 在 PBS 中的 Tm 都约为 60 °C，说明 CPM 没有改变 BLG 的 Tm 读数。这为膜蛋白提供了一条可选的检测通路：内源荧光被去垢剂背景干扰时，可以改用 CPM 荧光测 Tm。本文没有测膜蛋白，这一用法要在具体膜蛋白上验证。
三种染料的结合机制和分析波段不同，适用场景也不同：
染料 / 结合机制 / 软件分析方式 / 适用场景
SYPRO Orange:结合机制 疏水表面;软件分析方式 536–650 nm 荧光面积;适用场景 通用蛋白，尤其是想同时比较内源荧光和染料荧光时
ANS:结合机制 疏水表面;软件分析方式 400–630 nm BCM;适用场景 无色氨酸或色氨酸少的蛋白（如 RNase A）
CPM:结合机制 自由半胱氨酸（巯基反应）;软件分析方式 400–650 nm 荧光面积;适用场景 含自由半胱氨酸的蛋白；用于膜蛋白要先在具体样品上验证
### 上机时要注意什么
选好应用、加载样品后，软件按染料类型自动选用上表的分析波段，从 nm 的全谱里同时算出内源荧光和染料荧光的结果。加染料的样品要配一组等体积 DMSO 对照，才能判断染料是否改变了 Tm 或 Tagg。