Sunny Suite 清洗:空白未检出 RNA,脂质 <5 µg/mL

Sunny Suite 清洗:空白未检出 RNA,脂质 <5 µg/mL

LNP 和空白交替跑,自动清洗之后,空白里测不到 RNA,脂质残留低于 5 µg/mL。配方筛选要跑大量不同组成的实验,实验之间的交叉污染会直接破坏数据的可信度。Sunny Suite 用可重复使用的玻璃 Sunny 芯片(通道内壁 Ra 约 5 nm)配合自动化清洗程序,不必靠一次性芯片来隔离样品。

清洗体积由 mRNA 和荧光素的挑战测试定出。按这套清洗跑 96 个连续实验,正常配方的粒径 CV < 1%,穿插其中的聚集样品也没有影响后续实验。

Sunscreen:高通量 LNP 配方筛选平台。

Sunshine:LNP 工艺优化和连续生产平台。

驱动液本身就是清洗液

Sunscreen 和 Sunshine 用驱动液(通常就是配方中使用的溶剂和缓冲液,如乙醇和醋酸缓冲液)推送样品通过 Sunny 芯片。样品通过后,驱动液继续流过整个流路(从输入端、经过 Sunny、到收集器和针头),相当于每个实验都自带一次冲洗。在此基础上,设备在每两个实验之间还会执行一次自动清洗循环,最后一个实验结束后做一次更充分的终末清洗。Sunscreen 的清洗还额外冲洗样品环路(Sunshine 只在系列结束时清洗环路)。

Sunny 芯片用化学惰性玻璃制成,通道内壁粗糙度只有 Ra 约 5 nm,而注塑成型的塑料芯片通常在 1–3 µm。通道壁这么光滑,有助于保持流路畅通,降低交叉污染的风险。

清洗流程示意:左 = 驱动液冲洗系统;中 = 样品包(蓝/绿色染料表示)通过 Sunny 芯片;右 = 驱动液再次冲洗,清除流路中的残留物。

用 mRNA 和荧光素做挑战测试,定出清洗体积

清洗体积按挑战测试的结果确定。测试用 mRNA(UV-Vis 检测)和荧光素(高灵敏荧光检测),逐步增加清洗体积:mRNA 的残留在很小的清洗体积下就降到了 UV-Vis 检测不到的水平;荧光素因为检测灵敏度更高,在总清洗体积达到 1.8 mL 时降到检测限以下。

据此设定清洗体积:标准清洗 1 mL/输入端(Sunscreen 的输入和收集清洗为 1.4 mL),连高荧光的残留也足以清除;需要更彻底时,可选深度清洗 1.6 mL/输入端。挑战测试里的 1.8 mL 是总清洗体积,这两个体积按每个输入端计,口径不同。

残留百分比 vs 清洗体积(µL)。mRNA(UV-Vis 检测,5 mL/min)迅速降到 0。荧光素(荧光检测,5 mL/min)在 ~1800 µL 时降到检测限。绿色虚线标记 Sunscreen 的标准清洗体积。

96 个连续实验,CV 不到 1%

在 Sunscreen 上连续跑了 96 个 DOTAP LNP 实验(Sunny 490 Trident T,TFR 9 mL/min,FRR 3:1)。其中 90 个是标准配方,穿插了 2 组三重复的"坏配方"(不含 PEG 脂质,会发生剧烈聚集,粒径和 PDI 显著升高)。目的是测试灾难性聚集事件后系统能否正常恢复。

结果:90 个正常配方的粒径 CV 不到 1%。紧接"坏配方"后面的正常配方和其他位置的结果没有差异:剧烈聚集的样品没有影响后续实验,清洗就消除了交叉污染。

96 个 DOTAP LNP 连续实验的 Z-Average(柱状图)和 PDI(蓝点)。标注位置为 2 组无 PEG 配方(剧烈聚集),前后的正常配方不受影响。90 个正常实验 CV < 1%。

RNA 残留:LNP 和空白交替跑,空白检测不到 RNA

在 Sunscreen 上用 Sunny 100 X(8 mL/min,FRR 3:1)做了 6 个连续实验:1、3、5 号位为 SM-102 LNP(含 ~100 µg/mL PolyA,10 mM 脂质),2、4、6 号位为纯驱动液空白。用 Stunner 的 UV-Vis + Unmix 算法定量每个位置的 PolyA 浓度。

~100 µg/mL 的 PolyA 按 FRR 3:1 混合后被稀释到四分之三,预期约 75 µg/mL;LNP 位实测分别为 77、78、76 µg/mL,与预期相符。三个空白位的 RNA 吸光度均为 0,没有检测到从上一个 LNP 实验带过来的核酸残留。

交替排列的 LNP(Sample)和空白(Blank)的 PolyA 浓度。LNP 位:77/78/76 µg/mL。空白位:全部为 0。Stunner UV-Vis + Unmix 检测。

脂质残留:荧光脂质做挑战,空白低于定量限

脂质本身 UV 吸收弱,不容易直接用光谱检测残留。用亲脂性荧光染料 DiO'C18(3) 做挑战测试:这种染料嵌入脂质双分子层后荧光信号很强,在水相中荧光很弱,灵敏度远高于 UV 检测。在 Sunscreen 上交替运行含 0.1 mol% DiO' 的 LNP 配方和不含染料的空白配方。

所有空白位的荧光信号都低于定量限(定义为样品空白信号的 5 倍)。换算成总浓度,脂质残留低于 5 µg/mL:配方总脂质浓度为 1550 µg/mL,残留比低于 0.33%。

DiO' 荧光染料交替测试:含染料的 LNP 位荧光信号正常(绿色),空白位荧光信号全部低于定量限。脂质残留 < 5 µg/mL(初始浓度 1550 µg/mL)。