LNP 从零开始 · 第 8 篇
2019 年 12 月，第一例 COVID-19 病例被报告。2020 年 12 月，两支 mRNA 疫苗获得紧急使用授权。传统疫苗开发需要 10–15 年，mRNA 疫苗用不到 1 年就完成了从序列设计到大规模接种的全过程。这个速度建立在几十年核酸化学和 LNP 递送技术的积累之上，其中关键一步是 m1Ψ 核苷修饰。
传统疫苗的开发路径通常是这样的：找到病原体 → 培养或灭活 → 大量动物实验 → 三期临床试验 → 建工厂 → 申请审批。整个流程走下来，10 年算快的。天花疫苗花了近两百年才在全球普及，脊髓灰质炎疫苗从发现到批量生产用了 20 年，流感疫苗每年还要靠鸡胚培养来赶在流行季前更新毒株。
mRNA 疫苗打破了这个节奏。2020 年 1 月 11 日，SARS-CoV-2 的基因组序列被公开发表。两天后，Moderna 就完成了 mRNA-1273 的序列设计。3 月 16 日，第一位志愿者接种了 mRNA-1273 的 I 期临床试验首剂。11 月，Pfizer-BioNTech（BNT162b2）和 Moderna（mRNA-1273）先后报告了超过 94% 的有效率。12 月，两支疫苗先后获得美国 FDA 的紧急使用授权（EUA），全球大规模接种随即展开。
这个速度背后有三十多年的基础研究积累：早在 1990 年代，科学家就证明了体外转录（IVT）的 mRNA 在小鼠体内能翻译出蛋白质。但 mRNA 天生不稳定、容易被核酸酶降解、会触发强烈的先天免疫反应，这些问题让它在临床上一直走不通。突破性的转折来自 Katalin Karikó 和 Drew Weissman 2005 年的工作。他们发现，用假尿嘧啶核苷（Ψ）替换 mRNA 中的尿嘧啶，可以大幅降低先天免疫激活。后来的衍生物 N1-甲基假尿嘧啶核苷（m1Ψ）进一步提高了蛋白表达效率。2023 年，两人因这项工作获得诺贝尔生理学或医学奖。
与此同时，2010 年代 LNP 递送技术的成熟解决了另一半难题：怎么把 mRNA 安全高效地送进人体细胞。当 2020 年的疫情到来时，mRNA 平台已经在技术上"准备好了"，缺的只是一个临床验证的机会。COVID-19 给了这个机会，而 mRNA 疫苗用最终的临床数据验证了这条技术路线。
时期 / 进展 / 对 mRNA 疫苗的影响
20 世纪末:进展 IVT mRNA 在小鼠中表达蛋白;对 mRNA 疫苗的影响 概念验证，但临床不可行
2005:进展 Karikó & Weissman 发现核苷修饰;对 mRNA 疫苗的影响 奠定免疫安全性和高表达的基础
2010 年代:进展 LNP 技术成熟，微流控制备标准化;对 mRNA 疫苗的影响 安全高效的递送载体就位
2019–2020:进展 COVID-19 大流行;对 mRNA 疫苗的影响 一年内完成两支疫苗的开发和授权
2021 至今:进展 管线扩展到传染病、癌症、遗传病;对 mRNA 疫苗的影响 从疫苗平台走向通用治疗平台
2023:进展 Karikó & Weissman 获诺贝尔奖;对 mRNA 疫苗的影响 核苷修饰的学术价值被最高认可
传统疫苗的逻辑是把一个降低了致病性的抗原样本送进身体（灭活病毒、减毒活病毒或蛋白亚单位），让免疫系统认识它。下次真正感染时，免疫系统就能快速反应。mRNA 疫苗换了一条路：它递送的是编码抗原的 mRNA，相当于一份"说明书"，由接种者自身的细胞照着生产这个抗原。
以 COVID-19 疫苗为例。mRNA 被包裹在 LNP 里，通过肌肉注射进入三角肌。LNP 被注射部位的抗原呈递细胞（antigen presenting cells, APCs，主要是树突状细胞和巨噬细胞）通过内吞作用摄取。LNP 在内体酸性环境下释放 mRNA 进入细胞质，核糖体把 mRNA 翻译成抗原蛋白（刺突蛋白）。
接下来发生的免疫反应走两条路径，最终汇合成一个完整的防御体系：
### 路径一：MHC I → 杀伤性 T 细胞
抗原蛋白在细胞内被蛋白酶体切割成短肽片段，装载到 MHC I 类分子上并呈递到细胞表面。CD8⁺ 细胞毒性 T 细胞识别这些"危险信号"后被激活，获得直接杀死被感染细胞的能力。这是病毒进入细胞后的最后一道防线。
### 路径二：MHC II → 辅助性 T 细胞 + B 细胞
分泌到胞外或被其他 APC 内吞的抗原蛋白，通过 MHC II 类分子呈递给 CD4⁺ 辅助性 T 细胞。CD4⁺ T 细胞通过细胞因子信号促进 B 细胞分化，驱动抗体产生和亲和力成熟。淋巴结中的生发中心形成高亲和力抗体和记忆 B 细胞。
COVID-19 mRNA 疫苗在人体中诱导Th1 为主的 CD4⁺ T 细胞应答：走的是"杀灭病原体"的路线，避开了可能引发过度炎症的 Th2 路线。这对疫苗安全性很重要。同时产生了高滴度的针对刺突蛋白受体结合域（RBD）的中和抗体。初次免疫后约 14 天可检测到抗体，第二剂后抗体水平大幅升高。这套双路径免疫（体液免疫产生中和抗体 + 细胞免疫产生杀伤性 T 细胞）是 mRNA 疫苗高有效率的核心原因。
mRNA 的表达是瞬时的。肌肉注射后，注射部位的表达最长约 10 天，到达肝脏的部分只表达 1–4 天。抗原蛋白在这段时间里生产出来、激活免疫系统，然后 mRNA 自行降解消失。不会有持续的抗原暴露，也没有基因组整合的风险。这是 mRNA 疫苗相对于 DNA 疫苗和病毒载体疫苗的一个天然安全优势。
BNT162b2（Pfizer-BioNTech）和 mRNA-1273（Moderna）都编码 SARS-CoV-2 的刺突蛋白。
刺突蛋白在自然状态下会从"融合前构象"（prefusion）翻转为"融合后构象"（postfusion），而人体需要识别的是融合前构象，这才是病毒还没进入细胞时的样子。两支疫苗都引入了K986P 和 V987P 两个脯氨酸突变（合称 S-2P），用脯氨酸的刚性侧链把刺突蛋白锁定在融合前构象。这样免疫系统识别到的是最具保护性的抗原形态。弗林蛋白酶切割位点也做了改造，防止刺突蛋白在表达过程中被提前切割。
两支疫苗都对 mRNA 序列做了系统性工程优化。密码子优化（codon optimization）把编码序列调整为人体细胞偏好的密码子频率，提高翻译速率。干扰正常翻译的信号（比如隐含剪接位点）被逐一清除。5' UTR 修改以促进核糖体结合和翻译起始，poly(A) 尾增强 mRNA 稳定性、延长细胞质中的半衰期。最关键的是核苷修饰，两支疫苗都用了 N1-甲基假尿嘧啶核苷（m1Ψ），下一节单独讲。
两支疫苗的 LNP 都由四种脂质组成。可电离脂质在低 pH 下带正电，结合 mRNA 并在内体中促进逃逸。辅助磷脂维持膜流动性与结构完整性，胆固醇增强稳定性。PEG 化脂质延长循环、减少非特异性吸附。LNP 通过微流控混合制备：脂质溶于乙醇相，mRNA 溶于酸性水相，两相快速接触。可电离脂质质子化带正电，与 mRNA 静电结合，自组装形成纳米颗粒。
mRNA 通过体外转录（IVT）生产：用噬菌体来源的 RNA 聚合酶在线性化 DNA 模板上转录合成。产物经层析纯化和过滤去除双链 RNA 等杂质，用毛细管电泳和质谱做质量控制。LNP 制剂经透析或切向流过滤（TFF）去除乙醇、调整到目标缓冲液。储存环节同样不简单：配方团队需要筛选冷冻保护剂，防止纳米颗粒在冷冻和解冻过程中聚集。团队还要在多种温湿度条件下测试降解速率，最终建立冷链储运标准。BNT162b2 最初需要 -70°C 储存，主要是为了压低 mRNA 的水解速率，所以 mRNA-LNP 的稳定性直接决定了疫苗能送到多远的地方。
核苷修饰要解决的问题出在先天免疫系统。
人体细胞内有一套检测机制：Toll 样受体（TLR3、TLR7、TLR8）和 RIG-I 等模式识别受体，它们的功能就是检测外来的 RNA。未经修饰的 IVT mRNA 一旦进入细胞，会被这些受体识别为入侵信号，触发强烈的炎症反应。干扰素和促炎细胞因子大量释放，mRNA 被迅速降解，蛋白翻译被全面抑制。结果是 mRNA 还没来得及表达多少蛋白质，就已经被免疫系统清除了。
Karikó 和 Weissman 的解决办法是用修饰核苷替换 mRNA 中的所有尿嘧啶（U）。最早用的是假尿嘧啶核苷（Ψ），两支疫苗用的是它的衍生物 m1Ψ。这个修饰让 TLR 等受体对 mRNA 的识别大幅减弱，先天免疫激活随之降低。同时，m1Ψ 修饰后的 mRNA 更稳定，不容易被 RNase 降解，蛋白表达效率大幅提升：文献报告显示，与未修饰的 mRNA 相比，蛋白表达量最高可提升 44 倍。
除了 m1Ψ，还有其他核苷修饰方案（比如 5-甲基胞嘧啶核苷 m5C）也能保护 mRNA 不被降解。m1Ψ 在降低免疫激活和提升翻译效率之间取得了较好的平衡，所以 BNT162b2 和 mRNA-1273 都选择了它。两支疫苗报告的有效率都超过 94%，核苷修饰是技术基石之一。
核苷修饰解决的是 mRNA 药物最核心的矛盾。药物要把一段外源 RNA 送进人体细胞并表达蛋白质，而免疫系统天生就要识别和消灭外源 RNA。m1Ψ 修饰并不完全消除这种识别，它把免疫刺激压到合适的水平：低到不会引发有害的炎症反应，又留有足够的抗原表达来训练适应性免疫。找到这个平衡点，是整个 mRNA 药物领域从实验室走向临床的前提条件。
按结构设计，合成 mRNA 可以分为三类，各有优势和限制。
### 非复制型 mRNA（nrRNA）
这是目前最主流的架构，BNT162b2 和 mRNA-1273 都属于这一类。结构简洁：5' 帽 + 5' UTR + ORF（编码抗原）+ 3' UTR + poly(A) 尾。它们通过修饰核苷降低免疫激活，靠一次性翻译表达抗原蛋白，诱导免疫反应。表达是瞬时的，安全性好。缺点是剂量需求相对较高，因为 mRNA 不会自我复制。
### 自扩增 mRNA（saRNA）
saRNA 在编码抗原的 ORF 之外，还包含一套来自甲病毒（alphavirus）的非结构蛋白基因（nsP1-4）。这些蛋白组成 RNA 依赖性 RNA 聚合酶（RdRp）复合物，让 mRNA 在细胞内自我复制。好处是用更低的剂量就能产生大量抗原蛋白，后面会提到的疟疾 mRNA 疫苗就选择了这个架构。2023 年 11 月，日本批准了 ARCT-154，这是全球首个获批的 saRNA COVID-19 疫苗，用量低于 BNT162b2 和 mRNA-1273。代价是分子更大（约 9–12 kb，而 BNT162b2 这类 nrRNA 在 4 kb 左右），制备和递送更有挑战性。
### 环形 RNA（circRNA）
circRNA 是共价闭合的环状分子，没有 5' 和 3' 末端，因此对外切核酸酶高度抵抗。与线性 mRNA 相比，稳定性至少提升 2.5 倍。circRNA 不能被核糖体直接从 5' 帽开始扫描翻译，而是依赖内部核糖体进入位点（IRES）启动翻译。它在基因治疗、肿瘤学和疫苗开发中都有潜力，但离临床应用还有距离。
三种架构各有适用场景。nrRNA 在疫苗领域已经充分验证，是当前的主力。saRNA 特别适合需要低剂量、长时间抗原表达的场景（比如疟疾等热带传染病）。circRNA 的稳定性优势让它在需要减少冷链依赖的场景中有吸引力。未来的 mRNA 疫苗管线不会只用一种架构，会根据疾病特点选择最合适的那一种。
在 COVID-19 之前，科学家已经在为流感、寨卡、HIV 等病原体开发 mRNA 疫苗候选物；疫情中的临床成功大幅加速了这些管线的推进。
流感每年导致全球约 30–60 万人死亡。目前的流感疫苗大部分依赖鸡胚培养来生产，速度慢。病毒在鸡胚中传代时还可能发生适应性突变，降低疫苗与流行毒株的匹配度。mRNA 疫苗直接绕开了这个问题：只要拿到 HA 蛋白的序列就可以设计 mRNA，不依赖活病毒培养。
Moderna 早在 2016 年就用核苷修饰的 mRNA-LNP 开展了针对 H10N8 和 H7N9 亚型 HA 蛋白的临床试验。100 µg 剂量的 H10N8 mRNA 疫苗诱导了 78.3% 的 HAI 血清转化率和 87.0% 的微量中和试验血清转化率；50 µg 剂量的 H7N9 更是达到了 96.3% HAI 和 100% 微量中和血清转化率，安全性良好。另一个方向是开发"通用流感疫苗"，靶向保守的 HA 茎部区域（而不是每年都在变的 HA 头部），争取覆盖多个亚型。临床前研究已经证明，表达 HA 茎部或多种保守蛋白的 LNP 包封 mRNA 疫苗能够诱导广谱的体液免疫应答。
寨卡病毒 1947 年被发现，通常引起轻症或无症状感染，但 2015–2016 年的爆发暴露了它与胎儿神经缺陷的关联，引发全球关注。寨卡只有一个血清型，因此靶向保守的 prM-E 蛋白（前膜和包膜蛋白）可能提供广泛保护。在小鼠和恒河猴中，单剂核苷修饰的 mRNA-LNP 疫苗（表达 prM-E）就诱导了比灭活病毒疫苗或 DNA 疫苗高 50–100 倍的中和抗体滴度。
不过有一个棘手的问题：寨卡和登革病毒的包膜蛋白高度同源（54%–59% 序列相同）。设计不当的寨卡疫苗可能产生交叉反应性抗体，通过抗体依赖增强效应（ADE）加重登革感染。Moderna 和华盛顿大学为此设计了一种改造版 prM-E 疫苗（mRNA-1893），带有融合环突变以降低登革交叉反应。I 期临床试验中，10 µg 和 30 µg 剂量的血清转化率达到 94%–100%，耐受性良好。
全球约 3800 万人感染 HIV，到 2030 年可能达到 4200 万。HIV 之所以成为疫苗领域最大的挑战，是因为它的抗原变异极快，包膜蛋白（Env）又被厚厚的糖基化屏障保护，大部分中和表位都被遮挡住了。几十年的研究中，多种递送系统（阳离子纳米乳、DOTAP/DOPE 脂质体、聚合物、可电离脂质 LNP）都被用于临床前 mRNA 疫苗研究，结果喜忧参半。
一个有前景的方向是用 mRNA 编码广谱中和抗体（bnAbs），比如 VRC01。VRC01 在体外能中和 98% 的 HIV 毒株，但中和所需的抗体浓度因毒株而异。所以在 AMP 试验中，它总体没有显著降低感染；只对 VRC01 敏感的毒株，预防有效率为 75.4%。一次静脉注射核苷修饰的 mRNA-LNP 就能在小鼠体内产生 VRC01 抗体水平相当于高剂量蛋白递送的效果。这个策略绕开了传统疫苗思路中"让免疫系统自己产生广谱抗体"的难题，改为直接让体内细胞翻译这些抗体。
编码埃博拉糖蛋白的 LNP 包封 mRNA 疫苗已在小鼠和豚鼠中展示出保护性免疫。狂犬病方面，CureVac 的 CV7201 和 CV7202 使用未修饰的 mRNA（搭配或不搭配 LNP），在动物和人体中均诱导了强免疫应答，且 LNP 递送进一步提升了效果。疟疾则使用了自扩增 mRNA 策略：编码疟原虫分泌的 PMIF 蛋白和 PfGARP 抗原，在灵长类动物中增强了 T 细胞记忆并降低了寄生虫血症。这些结果表明 mRNA 疫苗的适用范围远不止呼吸道病毒。
疾病 / 靶抗原 / 策略 / 递送方式 / 关键结果
流感:靶抗原 / 策略 全长 HA（H10N8, H7N9）/ HA 茎部;递送方式 核苷修饰 mRNA + LNP;关键结果 临床试验安全性良好，免疫原性强
寨卡:靶抗原 / 策略 prM-E（含融合环突变）;递送方式 核苷修饰 mRNA + LNP;关键结果 I 期 94%–100% 血清转化率
HIV:靶抗原 / 策略 bnAb VRC01 / HIV Env 抗原;递送方式 LNP / 阳离子纳米乳 / 聚合物;关键结果 VRC01 体外中和 98% 毒株；对敏感毒株预防有效率 75.4%
埃博拉:靶抗原 / 策略 糖蛋白;递送方式 LNP 包封 mRNA;关键结果 小鼠和豚鼠保护性免疫
狂犬病:靶抗原 / 策略 CV7201 / CV7202 糖蛋白;递送方式 未修饰 mRNA ± LNP;关键结果 人体强免疫应答，LNP 提升效果
疟疾:靶抗原 / 策略 PMIF + PfGARP;递送方式 saRNA;关键结果 灵长类 T 细胞记忆增强，寄生虫血症下降
COVID-19 让 mRNA 疫苗的开发速度广为人知；和传统疫苗相比，它在安全性、免疫激活方式和平台扩展上也各有长处。
开发速度。传统疫苗依赖病原体培养、蛋白纯化或病毒灭活，每一步都需要生物学上的"等待时间"。mRNA 疫苗从序列设计到 GMP 级别的产品，理论上只需要拿到抗原的基因序列，用化学合成的方式就能生产。这让它在面对新发传染病时能快速响应。
安全性设计。传统减毒活疫苗有回复突变的风险（脊灰疫苗就出现过这个问题），灭活疫苗的免疫原性通常较弱需要佐剂配合。mRNA 疫苗不含活病毒、不整合到基因组、表达是瞬时的。mRNA 在完成翻译后自行降解，不会导致持续的抗原暴露或基因组毒性风险。
免疫激活的全面性。传统蛋白亚单位疫苗主要激活体液免疫（产生抗体），细胞免疫通常较弱。mRNA 疫苗的抗原在自体细胞内合成，因此天然通过 MHC I 和 MHC II 两条路径呈递。它同时激活 CD8⁺ 杀伤性 T 细胞和 CD4⁺ 辅助性 T 细胞，加上 B 细胞介导的抗体应答，形成体液+细胞的双重免疫。
平台可扩展性。mRNA 疫苗的生产流程高度标准化：不管编码的是流感 HA、寨卡 prM-E 还是 HIV Env，上游 IVT 和下游 LNP 包封的工艺基本相同。换一种抗原，你需要改变的主要只是 mRNA 序列本身。COVID-19 就是例子：序列 1 月 11 日公开，两天后 mRNA-1273 完成设计，3 月 16 日 I 期首剂接种。
当然，mRNA 疫苗也面临传统疫苗不需要操心的问题。冷链依赖前面已经提到：BNT162b2 最初要 -70°C，后来随稳定性数据补充，放宽到 -25 至 -15°C 存放两周和 2–8°C 短期储存。但在非洲、东南亚等缺乏超低温储运条件的地区，冷链仍然是硬障碍。冻干和热稳定配方在推进，但离常温储运还有距离。生产成本也高于传统疫苗：mRNA 的 GMP 级别生产设施和脂质原料的供应链在全球范围内并不均匀，中低收入国家在疫苗获取上处于劣势。WHO、GAVI 等国际组织正在通过技术转让和本地化生产来缩小这个差距。
另一个需要持续关注的问题是免疫持久性。mRNA 疫苗诱导的中和抗体滴度在接种后数月内会下降。是否需要定期加强针、如何优化免疫记忆、多表位疫苗设计能否覆盖不断变异的病原体，这些问题还在通过持续的临床研究来回答。
本文内容整理自：Raj Kumar (Ed.), Lipid Nanoparticle-based mRNA Delivery Systems, Academic Press (Elsevier), 2026, Chapter 10 (Sambridhi Bhowmik et al.)。流感疫苗血清转化率数据补充自 Hou X et al., Nat Rev Mater 2021;6:1078-1094。saRNA 疫苗获批信息补充自 Xu S et al., Mol Ther Methods Clin Dev 2025;33。