LNP 从零开始 · 第 5 篇
同一套脂质配方，用薄膜水化法做，mRNA 包封效率只有 5%–20%；用微流控做，优化后可达 >90%。差别来自混合：LNP 是自组装纳米结构，混合的速度和均匀性决定了颗粒的大小、均一度和包封效率。
LNP 靠自组装形成。把四种脂质（可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇、PEG-脂质）溶解在有机溶剂里，再和含有 mRNA 的水相溶液混在一起。脂质在水环境中变得不可溶，于是自发地包裹住 mRNA，形成纳米颗粒。听起来很简单，但"怎么混"决定了"混出什么"。
这背后的物理过程叫溶剂置换（solvent displacement）。脂质溶解在乙醇中，mRNA 溶解在酸性缓冲液中。当两股液流汇合，乙醇被水稀释，脂质的溶解度骤降，它们开始析出并自发聚集。在这个过程中，可电离脂质因为 pH 低于其 pKa 而带正电，通过静电作用吸引带负电的 mRNA，形成脂质-核酸复合物的核心。其他脂质随后围绕这个核心组装成完整的 LNP 结构。
关键在于混合的速度和均匀性。如果混合慢，乙醇和水相的接触就不均匀。有些区域乙醇先被稀释，脂质先析出、先开始聚集，形成大颗粒；有些区域还没开始反应。结果就是粒径分布很宽（PDI > 0.3），大颗粒和小颗粒混在一起。如果混合快而均匀，所有脂质几乎同时经历溶剂置换，同时开始成核、同时停止生长，产出的颗粒大小一致、结构统一。
根据能量输入和混合方式，制备方法可以粗略分为三大类。高能量方法靠外力强制分散，如高压均质、超声。低能量方法利用自发过程，如薄膜水化、微乳化。有机溶剂法是现代标准，如乙醇注入、微流控。这三类方法的发展，基本对应了 LNP 从实验室走向生产线的技术演进。
最经典的脂质体制备方法，源头可追溯到 1960 年代 Bangham 的工作。流程：脂质溶于有机溶剂（通常是氯仿或氯仿/甲醇混合物），倒进圆底烧瓶，用旋转蒸发仪在减压下缓慢旋转蒸干，脂质在烧瓶内壁形成一层薄膜。加入含 mRNA 的水相缓冲液，摇晃或超声让膜重新水化，脂质从瓶壁剥落，卷曲成多层囊泡（multilamellar vesicles, MLV）。这些 MLV 大小不一、层数各异，需要挤出机反复通过聚碳酸酯膜（孔径 100–200 nm）缩小粒径、提高均一度。
优点明显：设备简单（一台旋蒸 + 一个挤出器），成本低，操作门槛低，适合教学和小规模初筛。缺点也明显：mRNA 这类大分子包封效率只有 5%–20%（被物理截留在水相腔室的概率有限），粒径分布宽（PDI 通常 > 0.3），批次间重复性差；还要用氯仿这类有毒溶剂，对纯化和合规都是负担。更大的问题：没有放大路径。50 mL 烧瓶和 5 L 烧瓶里，薄膜均匀性、水化动力学完全不一样。
最简单的溶剂法：脂质溶于乙醇，用注射器快速注入搅拌的水相缓冲液。乙醇和水混合后，脂质溶解度下降，自发形成纳米颗粒。相比薄膜水化法，两个好处：不用氯仿（乙醇毒性低得多）；能直接产出较小的单层囊泡（unilamellar vesicles），省掉挤出步骤。
核心问题：可控性差。颗粒大小和均一度取决于注入速度、搅拌速率、注入点位置、液面高度，这些参数很难精确控制，尤其手动操作时。两个人做、同一人上下午做，结果都可能不一样。残留乙醇还要透析或超滤去除。乙醇注入本质上是微流控的早期原型：验证了溶剂置换能制备 LNP 的原理，但缺少精确控制混合动力学的手段。
高能量方法。粗制脂质分散液在 100–2000 bar 压力下强制通过微米级缝隙（均质阀），液流经历剪切、空化（cavitation）和湍流，大颗粒被打碎成亚微米级均匀小颗粒。在固体脂质纳米颗粒（SLN）的工业生产中已经成熟，有 50 L 规模、25 kg/小时产能下连续生产的报道。
优势是可放大性：从实验室到工业规模有成熟的工程路径，设备标准化程度高，重复性好。但对 mRNA-LNP 有关键局限：剪切力太大。mRNA 是上千核苷酸的线性分子，高压下的剧烈剪切和空化会物理打断 RNA 链，完整性下降、活性丧失。此外 HPH 设备昂贵、能耗高，研发阶段小批量筛选不经济。
超声探头或超声浴产生高频声波（20–40 kHz），在液体中制造空化气泡，气泡坍缩时产生局部高温高压和微射流，把大颗粒打碎成小颗粒。操作简单，实验室人人会用。但有两个明显缺陷：空化效应产生大量局部热量，mRNA 对温度敏感（60°C 以上加速降解），冰浴只能部分缓解；超声能量在液体中分布不均匀，靠近探头处强烈、远处微弱，颗粒大小不一致。需要精确控制粒径和保护 RNA 完整性的 mRNA-LNP 制备，超声不是好选择。
为什么传统方法不适合 mRNA-LNP？
mRNA 既脆弱又对条件敏感：高温加速降解，剪切会断裂 RNA 链，RNase 污染让分子失活。同时，它又需要极其均匀的混合条件来实现高包封效率。薄膜水化的包封效率太低，HPH 和超声的剪切力太大，乙醇注入的可控性太差。mRNA-LNP 需要一种能在毫秒内完成温和、均匀混合的方法，微流控正是为此开发出来的。
任何一款已获批的 mRNA-LNP 产品，生产都依赖某种形式的快速混合技术。比如 Onpattro（patisiran，2018 年获批的 siRNA-LNP）、BNT162b2（辉瑞/BioNTech COVID-19 疫苗）、mRNA-1273（Moderna COVID-19 疫苗）。微流控是其中最具代表性的方法，已经成为学术和工业界制备 mRNA-LNP 的事实标准。
微流控的核心思路是：把两股液流限制在几十到几百微米宽的微通道中，强制它们在极短的距离内接触混合。通道尺度小意味着扩散距离短，液流接触面积大（相对于体积），混合时间可以压缩到毫秒甚至微秒级。传统方法靠"大体积搅拌"，微流控里每一滴液体经历的混合条件则几乎完全相同。所以它的颗粒均一度和批次重复性远优于传统方法。
标准的微流控 LNP 制备过程：四种脂质溶解于乙醇形成有机相，mRNA 溶于酸性缓冲液形成水相。两股液流在微流控芯片中快速混合，脂质自组装包裹 mRNA，形成均匀的 LNP。随后 LNP 在接近中性 pH 条件下成熟。
微流控混合器的设计有好几种。理解它们的差异，有助于在实际工作中选择合适的平台。
最简单的设计：两个入口通道以 T 形或 Y 形汇合到一个出口通道。如果流速够快，液流本身的湍流就能让两股液体迅速混匀。T 型混合器的优点是结构简单、成本低、容易加工。但它有一个关键的局限：混合效率高度依赖流速。流速低时，两股液流在汇合处保持层流、各走各的，就像两条颜色不同的河汇合后，还要并排流很长一段才慢慢混匀。这时混合只能靠分子缓慢扩散完成。
只有流速足够快、液流变成湍流，混合才变得高效。这让 T 型混合器的工艺窗口比较窄：太慢混不匀，太快又可能造成通道内压力过大。
SHM 的通道底部刻有人字形（herringbone）微槽纹。这些槽纹产生一种叫混沌对流（chaotic advection）的流体行为：液流经过每一组槽纹时被反复折叠和拉伸。经过十几组槽纹后，原本分层的两股液体已经被折叠成百上千次，接触面积指数级增加，混合非常充分。和 T 型混合器不同，SHM 在较低流速下就能实现高效混合（因为混合不靠湍流，靠几何结构驱动的混沌对流），工艺窗口更宽。这种设计被很多研究平台采用。
HFF 的设计原理不同于前面两种。有机相液流被两侧的水相液流"夹挤"成一层很薄的流体片（通常只有几微米厚）。因为有机相层极薄，乙醇分子只需扩散很短的距离就能到达水相界面。混合完全靠分子扩散完成，不需要湍流，也不需要槽纹。HFF 的优势在于混合条件非常温和（没有剪切力），对 RNA 的保护最好，粒径可以通过调节流速比精确控制。劣势是通量较低，更适合小规模研究和精确的参数探索。
IJM 采用完全不同的思路：两股高速液流在一个小混合腔内迎面对撞。撞击产生极强的湍流，混合时间可以压缩到微秒级，是所有混合器中最快的。iLiNP 等撞击射流装置可以在 20–50 mL/min 的流速下产出 20–60 nm 的 LNP，已经接近临床和商业生产的通量需求。IJM 的优势是通量高、混合极快、适合放大。不足之处在于对流速的精确控制要求高，而且高速撞击产生的剪切力比 SHM 和 HFF 更大（虽然比 HPH 温和得多）。
微流控为什么赢了？
- →精确的参数控制：通过调节 FRR（Flow Rate Ratio，水相/有机相流速比）和 TFR（Total Flow Rate，总流速），可以精确调控粒径和 PDI。
- →极高的重复性：批次间粒径的相对标准偏差（RSD）通常 < 5%，远优于任何手动方法。
- →清晰的放大路径：从研发到生产，可以通过并行化（numbering-up）或切换到更高通量的混合器来放大，而不需要改变混合原理。
微流控给了你精确控制的能力，但可调的参数也太多了。一个经验丰富的配方科学家在微流控平台上做 LNP，通常要在以下几个关键参数之间找到最佳平衡点。
水相和有机相的体积流速之比，是影响粒径最直接的参数。典型范围是 3:1 到 5:1（水相：有机相）。FRR 越高，混合后乙醇被稀释得越快，脂质更迅速地达到不可溶状态。成核速度快，颗粒来不及长大就停止了，产出的颗粒更小。反过来，FRR 低的时候，混合液中乙醇浓度相对较高，脂质析出慢，有更多时间聚集生长，颗粒就更大，组装也可能不完全。
两股液流的总体积流速。TFR 决定了液流通过混合区域的速度。TFR 越高，混合越快（液流来不及层流就被强制混匀），通常产出更小、更均匀的颗粒。但 TFR 不能无限增大：太快会造成通道内背压过高（尤其是通道截面较小的芯片），甚至可能超出泵的能力范围。而且在某些混合器设计（如 SHM）里，过高的流速反而会让混沌对流效果变差：液流太快，来不及被槽纹充分折叠就通过了。所以 TFR 也有一个最佳窗口，需要根据具体的芯片设计来确定。
可电离脂质上可质子化的氮原子的摩尔数与 mRNA 上磷酸基团的摩尔数之比。这个参数决定了每条 mRNA 对应多少脂质。典型范围是 3:1 到 6:1。N/P 太低，脂质不够，mRNA 结合不完全，包封效率（EE）低。一部分 mRNA 游离在颗粒外面，既浪费原料又可能引起不必要的免疫反应。N/P 太高，脂质过量，多余的脂质可能形成空的脂质颗粒或者附着在 LNP 表面，增加毒性。
COVID-19 疫苗使用的 N/P 比大约是 6:1。这个数值是大量筛选后的结果，它在 EE、颗粒稳定性和体内安全性之间取得了平衡。
水相通常使用 pH 4.0 左右的柠檬酸缓冲液。为什么要这么酸？因为可电离脂质（如 DLin-MC3-DMA、SM-102、ALC-0315）的 pKa 大约在 6.2–6.5 之间。在 pH 4.0 时，这些脂质上的氮原子被质子化、带正电，能通过静电吸引抓住带负电的 mRNA 磷酸骨架。如果 pH 太高（比如直接用中性缓冲液），脂质不带电，和 mRNA 之间没有静电吸引，包封效率会很差。但 pH 也不能太低：pH < 3 时酸性过强，mRNA 的化学键会被酸催化水解，造成 RNA 链断裂。
有机相中的脂质总浓度影响乙醇的粘度和混合动力学。浓度太高，乙醇粘稠，混合效率下降；浓度太低，则需要更大的体积才能获得足够的脂质量，不经济。有些方案在 40–50°C 下操作。升温可以降低脂质溶液的粘度、加速扩散、改善混合效果，但也带来 mRNA 降解的风险。
参数之间不是独立的
FRR、TFR、N/P、pH、脂质浓度、温度这些参数互相耦合。提高 FRR 会改变混合后的乙醇浓度，影响脂质的析出动力学；改变 TFR 会影响混合时间，进而影响 FRR 的效果。你不能逐个优化，必须系统地探索参数空间。所以 DoE（Design of Experiments，实验设计）方法在 LNP 工艺开发中越来越普遍。它用统计设计的实验矩阵，以最少的实验次数覆盖最大的参数空间，找到各参数的最优组合和交互效应。
从微流控芯片出来的液体还不是成品，离可以注射到人体里还差好几步。
从芯片出口收集到的混合液，乙醇含量通常在 20%–25%（v/v）（以 FRR 3:1 为例，有机相占总体积的 25%）。pH 还停留在酸性（~4.0）。可能还存在没有被包裹进 LNP 的游离 mRNA。这样的液体直接注射会造成溶血、组织损伤和剧烈的局部反应。所以混合只是制备的第一步，后处理（post-processing）同样关键。
最常用的方法是切向流过滤（Tangential Flow Filtration, TFF）。TFF 把 LNP 悬浮液泵过一张膜。膜的孔径够小，LNP（60–150 nm）无法通过，被截留在膜的一侧；乙醇、盐离子、小分子缓冲组分则可以穿过膜进入滤液侧。同时，从膜的进料侧持续补入新的中性缓冲液（PBS 或组氨酸缓冲液），稀释残留的乙醇并将 pH 从 4.0 逐渐调到 7.4 附近。反复循环几次后，乙醇浓度降到可接受范围（通常 < 0.5%），pH 达到生理水平，同时 LNP 悬浮液被浓缩到所需的浓度。
小规模研究中也可以用透析（把混合液装在透析袋里，泡在大量缓冲液中让乙醇扩散出去），但透析耗时长（通常过夜）、不适合放大。TFF 可以在几小时内完成，而且是连续操作，适合 GMP 环境。
缓冲液置换过程中，pH 从酸性升到中性有一个重要的物理化学意义：可电离脂质在 pH > pKa 时失去正电荷、变为中性。这使得 LNP 表面在生理环境中不带电（或带微弱电荷），降低了与血清蛋白的非特异性吸附、减少巨噬细胞的清除，延长了循环时间。同时，LNP 的内部结构也在 pH 从酸性跃迁到中性的过程中发生重组。可电离脂质失去电荷后，脂质分子之间的排列方式改变，从松散的带电状态变为紧密的中性堆积。这个过程被称为"成熟"（maturation），成熟后的 LNP 更稳定、结构更紧凑。
TFF 完成后，LNP 悬浮液通过 0.2 μm 的无菌级滤膜进行除菌过滤。LNP 的粒径通常在 60–150 nm，远小于 0.2 μm（200 nm）的截留孔径，可以顺利通过。这是 LNP 相对于病毒载体的一个关键优势。腺相关病毒（AAV）的直径约 25 nm，理论上也能通过 0.2 μm 滤膜，但 AAV 颗粒容易聚集，实际过滤时损失大；而慢病毒（直径 80–120 nm）和腺病毒（直径约 90 nm）的聚集体甚至可以堵住滤膜，生产中通常只能靠层流罩+无菌操作来保证无菌性，合规成本更高。LNP 能直接除菌过滤，不必只靠层流罩和无菌操作来保证无菌。
过滤后的 LNP 悬浮液要加入冻干保护剂（cryoprotectant，一种在冷冻过程中保护纳米颗粒结构不被冰晶破坏的糖类分子）。常用的有蔗糖（sucrose）和海藻糖（trehalose），浓度通常在 5%–10%（w/v）。然后分装到西林瓶中，冷冻保存。辉瑞的 BNT162b2 最初要求 -70°C 左右保存，主要限制是 mRNA 本身的水解；随着稳定性数据补充，后来允许在 -25 至 -15°C 短期存放。Moderna 的 mRNA-1273 从一开始就可以在 -20°C 保存，2–8°C 下可稳定 30 天。
微流控的混合效果来自通道的小尺度：几十到几百微米的通道宽度让两股液流在极短的距离内充分接触。但这恰恰也是放大的核心矛盾：把通道做大，混合条件就变了。一个在 100 μm 通道里调好的配方，在 1 mm 通道里可能产出完全不同的颗粒。原因在扩散：一滴墨水在小杯子里几秒就散开，在游泳池里却要等很久。同样，通道越宽，两股液流靠扩散混匀需要的时间就越长（扩散时间和距离的平方成正比，通道宽 10 倍，混合时间就慢 100 倍）。
微流控放大最直觉的策略是把很多小通道并联起来。每个通道保持原来的尺寸和混合条件不变，靠增加通道数量提高总通量。这就是 numbering-up（并行化）。它的核心优势是每个通道里的混合动力学和单通道完全一致。研发阶段优化好的参数可以直接用到多通道系统，不需要重新摸索条件。
但并行化也有工程挑战：怎么保证每个通道的流速完全一样（流体分配均匀性），怎么检测单个通道是否堵塞。通道数目增加到几十甚至上百时，还要维持稳定的背压分配。这些都是工程问题。但从物理原理上说，并行化是最可靠的放大路径，因为它不改变混合的基本物理条件。
撞击射流混合器由于混合腔体积较大、混合靠湍流驱动而非通道几何驱动，天然适合更高的通量。单个 IJM 设备可以在 50+ mL/min 的流速下工作，已经被用于临床试验和商业生产规模的 LNP 制备。对于需要一次产出数升甚至数十升 LNP 的临床生产场景，IJM 是目前最成熟的方案之一。
不管用哪种放大策略，配方科学家面对的核心问题都是：小批量和大批量做出来的产品一样吗？
冻干（lyophilization，即冷冻干燥）是解决冷链问题的一个方向。把 LNP 悬浮液和冻干保护剂一起冷冻、然后在真空下升华除水，得到干粉。干粉可以在 2–8°C 甚至室温下长期保存，使用前加水复溶即可。冻干工艺的难点是冷冻和干燥过程中形成的冰晶可能破坏 LNP 的膜结构，导致复溶后粒径增大、EE 下降。冻干保护剂（蔗糖、海藻糖）的作用就是替代水分子的氢键网络，在脱水状态下维持脂质膜的结构完整性。优化冻干工艺（冷冻速率、干燥温度、真空度）和保护剂配方（类型、浓度、与脂质的比例），是当前 LNP 稳定性研究的一个活跃方向。
回到研发阶段，Sunscreen 这类微流控平台让配方筛选和工艺优化在同一套系统上从微升级走到毫升级，缩短从发现到中试的距离。
本文内容整理自：Raj Kumar (Ed.), Lipid Nanoparticle-based mRNA Delivery Systems, Academic Press (Elsevier), 2026, Chapter 4 §3-4, §10-11 (Ushasi Das et al.)。