LNP 从零开始 · 第 3 篇
BNT162b2 和 mRNA-1273 用的可电离脂质不同，LNP（脂质纳米颗粒）里四种脂质的摩尔比却都接近 50:10:38.5:1.5。从外面看，LNP 像一个小小的脂肪球；拆开来，它是四种不同类型的脂质按精确配比自组装成的纳米结构。每种脂质都有自己的角色，改变任何一种都会影响整个系统的性能。
一颗功能完整的 LNP 由四类脂质分子自组装而成：可电离脂质（ionizable lipid）、磷脂（phospholipid，也叫辅助脂质）、胆固醇（cholesterol）、PEG-脂质（PEGylated lipid）。四者缺一不可：去掉任何一种，要么 mRNA 包不进去，要么颗粒不稳定，要么细胞不摄取，要么进了细胞也出不来。
目前业界广泛使用的典型摩尔比是：可电离脂质 50% / 磷脂 10% / 胆固醇 38.5% / PEG-脂质 1.5%。这个配方并非随意定的，它来自大量筛选优化的结果。Pfizer/BioNTech 的 BNT162b2 和 Moderna 的 mRNA-1273 都大致遵循这个比例（具体的可电离脂质种类不同，但摩尔比接近）。但这只是一个起点配方，不同的应用场景（疫苗 vs. 肝脏基因编辑 vs. 肺部递送）往往需要不同的比例。
LNP 的四种脂质组分（可电离脂质、磷脂、PEG-脂质和胆固醇）各司其职。四者共同赋予 LNP 稳定性、低免疫原性、可重复性、细胞靶向能力、可定制设计、RNA 保护、降低致突变性和无病毒蛋白等特性。
这里有一个常见误解需要纠正：LNP 不是脂质体（liposome）。传统脂质体是一个中空的磷脂双层囊泡，内部包裹水溶液，药物溶解在水相或嵌入膜中。LNP 的结构完全不同。
冷冻电镜（cryo-TEM）观察显示，LNP 内部是实心的：一个致密的、无序的脂质核心，其中分布着反向胶束（inverted micelle）结构。每个反向胶束是一个被脂质分子包裹的小水滴，脂质的亲水头基朝内（围着水和 mRNA），疏水尾部朝外。这些小水滴-脂质单元密密麻麻地分布在整个 LNP 内部。整个颗粒的外表面被一层 PEG-脂质覆盖。这种结构解释了为什么 LNP 能实现高达 90% 以上的 mRNA 包封效率；传统脂质体只靠水相腔被动截留，包封大分子核酸的效率低得多（本系列讲制备方法时给出了薄膜水化法的数据）。
可电离脂质是 LNP 中占比最高的组分（约 50 mol%），也是决定递送效率的最关键因素。它之所以叫"可电离"，是因为它的电荷状态随 pH 变化。这个特性直接决定了 LNP 能不能把 mRNA 包进去、能不能在体内安全循环、能不能在细胞内把 mRNA 释放出来。
一个可电离脂质分子由三个功能区域组成：可质子化的氨基头基，通常是叔胺或二甲胺基团，这是 pH 响应的核心部位；连接基团（linker），把头基和尾部连起来的化学桥，常见的有酯键、醚键、酰胺键等；疏水尾部，一条或多条碳氢链，决定了脂质在脂质层中的排列方式。尾部的长度、分支、不饱和度和是否含有可降解键（如酯键），都会影响 LNP 的性能。
这是可电离脂质设计的关键。先解释一下 pKa：它衡量的是一个分子"在什么 pH 下开始带电"。pKa = 6.5 意味着当环境 pH 降到 6.5 以下时，这个分子超过一半会被质子化（氢离子 H⁺ 结合到氨基上）而带正电；pH 高于 6.5 时，大部分分子失去质子、变回电中性。可电离脂质的 pKa 通常设计在 6.2–6.5 之间，这意味着：
pKa 的精确范围很讲究。早期针对 siRNA 肝脏递送的系统筛选（Jayaraman 等人 2012 年的工作）发现，pKa 在 6.2–6.5 之间的可电离脂质体内递送效果最好；而后续针对 mRNA 疫苗的研究则发现 pKa 范围可以更宽：SM-102 的报道 pKa 约 6.68，ALC-0315 约 6.09，两者都在疫苗中表现优异。这说明"最优 pKa"并不是一个固定的窗口，它取决于给药途径、靶细胞类型和整个配方的协同效应。肌肉注射（IM）后 LNP 主要被注射部位附近的免疫细胞直接吞噬，对 pKa 的精确值不那么敏感；而静脉注射（IV）后 LNP 需要在血液循环中存活并被肝脏特异性摄取，对表面电荷的要求更严格。
可电离脂质的前身是永久阳离子脂质，如 DOTAP、DOTMA，1980–1990 年代广泛用于体外转染，但毒性太大，临床应用受限。以 DLin-MC3-DMA（pKa 6.44）为代表的可电离脂质随后出现，Alnylam 的 Onpattro（2018 年获批的首个 LNP-siRNA 药物）就用了它，标志着可电离脂质在临床上的首次成功。COVID-19 疫苗使用的 SM-102（Moderna，pKa 6.68）和 ALC-0315（Pfizer/BioNTech，pKa 6.09）再进一步，尾部结构更复杂，引入了分支碳链和酯键。这段演化对应本系列上篇所讲脂质载体四代演化中的后三代。
分支碳链的设计出发点是：尾部分叉后分子变成倒锥形（尾部比头部宽）。这种几何促进脂质层弯曲和 HII 相形成，有助于在内体中撬动膜融合、帮助 mRNA 逃出。酯键的设计出发点是生物可降解性：酯键可以在体内被酯酶水解，加速脂质的代谢和清除，减少组织蓄积。Moderna 在 SM-102 中使用了这种可降解设计：它的尾部含有一个酯键，注射后脂质在体内被逐步降解为更小的代谢产物并排出体外。
发现这些脂质的方法也值得一提。研究者通常采用组合化学策略：把氨基头基、连接基团和疏水尾部分别看作三个零件库，每个库里准备多种选择。然后把所有可能的组合排列出来，一次合成数百甚至上千种候选脂质。再筛选它们的包封效率、粒径、pKa、体外转染活性和体内递送效果。Anderson 等人的经典工作就是用这种策略，从 500+ 候选分子中筛选出 C12-200（一种五尾可电离脂质），在小鼠体内实现了极低剂量（0.01 mg/kg）的 siRNA 递送。
磷脂在 LNP 中的占比不高（约 10 mol%），有时候被叫做"辅助脂质"（helper lipid）。它不仅参与颗粒外层结构的维持，还直接影响内体逃逸效率和器官靶向性。
目前 LNP 配方中最常用的磷脂是 DSPC 和 DOPE，两者的分子形状和由此带来的物理化学性质截然不同：
DSPC（二硬脂酰磷脂酰胆碱，distearoylphosphatidylcholine）的两条脂肪酸链是完全饱和的 C18 链，分子整体呈圆柱形（头和尾差不多粗细，像一根铅笔）。圆柱形分子能整齐地并排排列，形成平坦、致密的双层膜结构（类似细胞膜的基本架构），赋予 LNP 外壳良好的结构完整性和稳定性。Onpattro 和 BNT162b2 都选择了 DSPC。它的优势在于：颗粒更稳定、储存条件更宽松、血清中脂质交换更少。
DOPE（二油酰磷脂酰乙醇胺，dioleoylphosphatidylethanolamine）的两条脂肪酸链各含一个顺式双键（C18:1），这让尾部弯曲。加上乙醇胺头基比胆碱头基小，分子整体呈倒锥形（inverted cone，头小尾大，像一个倒过来的甜筒）。
这种形状的分子凑在一起时，没法排成平整的双层膜，分子之间会留出空隙。这类分子倾向于弯曲成管状结构，这就是六方 II 相（hexagonal HII phase）。当内体酸化时，DOPE 从层状排列向 HII 相转变，膜的局部结构被打乱，促进 LNP 膜与内体膜融合，让 mRNA 逃出。用 DOPE 替代 DSPC 的 LNP 通常在体外转染实验中表现更好，但粒径控制和储存稳定性可能不如 DSPC 版本。
2021 年，Liu 课题组报道了一类全新的概念：可电离磷脂（ionizable phospholipids, iPhos）。传统磷脂只起结构和辅助作用，而 iPhos 同时具有磷脂的结构功能和可电离脂质的 pH 响应功能。他们设计的 9A1P9 在小鼠体内的 mRNA 递送效率是用 DSPC 配方的 40 倍，是用 DOPE 配方的 965 倍。这个差距说明，磷脂组分本身就能改变递送效率，作用不止于填充结构。
磷脂的选择还会影响 LNP 的器官分布。Cheng 等人的研究显示，在 LNP 中加入阴离子磷脂（如 DOPS 或 DOPG），可以把递送从肝脏重定向到脾脏。机制推测是：带负电的磷脂改变了 LNP 表面的蛋白冠（protein corona）组成，在血液中吸附了不同种类的载脂蛋白，而这些蛋白被不同器官的受体识别。两性离子磷脂（如 DSPC）倾向于吸附 ApoE（载脂蛋白 E），引导 LNP 到肝细胞；阴离子磷脂可能吸附不同的蛋白组合，引导到脾脏的免疫细胞。这个发现给 LNP 的器官靶向设计打开了一个新维度。
胆固醇在 LNP 中的占比仅次于可电离脂质，通常在 38.5 mol% 左右。它在天然细胞膜中的作用早已被充分研究：调节膜流动性、增加膜的力学强度。在 LNP 中，它发挥的作用类似，但又不止于此。
胆固醇的分子结构很独特：四个碳环稠合在一起形成一个扁平、刚硬的骨架（叫甾体骨架，steroid skeleton；胆固醇、雌激素、睾酮都共享这个四环结构），下面连着一条短碳氢侧链，上面有一个亲水的羟基。这个扁平刚性分子可以插入其他脂质分子柔软的碳氢链之间，填充其间的空隙。这样做的效果是：增加脂质层的堆积密度、降低膜的通透性、减少血浆蛋白对膜的穿透。翻译成生物学语言：LNP 在血液循环中不容易破裂漏药，mRNA 不会在到达目标细胞之前就暴露并被核酸酶降解。
去掉胆固醇的后果很明显：LNP 的粒径增大、PDI（多分散性指数）升高、mRNA 包封效率下降、在含血清培养基中的稳定性急剧下降。有研究显示，不含胆固醇的 LNP 在 37°C 血清中 2 小时内就释放了大部分 mRNA，而含胆固醇的版本在 24 小时后仍保持 >80% 的包封。
近年来的研究揭示，胆固醇不仅仅是一个被动的结构组件。用不同的胆固醇衍生物替换天然胆固醇，可以大幅改变 LNP 的递送效率和器官分布：
此外，胆固醇本身也可能参与内体逃逸。内体膜天然含有大量胆固醇，而 LNP 中的胆固醇与内体膜胆固醇之间的相互作用可能促进膜融合。一些模拟实验表明，胆固醇在内体酸化条件下会重新分布到 LNP 的外表面，与内体膜发生接触和融合，协助可电离脂质在内体膜上形成破口。
PEG-脂质是 LNP 中占比最小的组分（通常 1–2 mol%），但它对颗粒的大小、稳定性和体内行为有着不成比例的影响。
PEG-脂质由两部分组成：一段亲水的 PEG 聚合物链和一个疏水的脂质锚定基团。PEG 链通常是分子量 2000 的聚乙二醇，即 PEG2000，大约 45 个乙二醇重复单元；脂质锚定基团如 DMG 的二肉豆蔻酰基或 DSPE 的二硬脂酰基。脂质锚插入 LNP 的脂质层，PEG 链伸展到颗粒表面之外，形成一层"刷状"的亲水保护层。
PEG-脂质在 LNP 中承担三个关键功能：
第一是控制粒径。在微流控混合过程中，当含有脂质的乙醇相与含有 mRNA 的水相快速混合时，脂质分子开始自组装。PEG-脂质因为 PEG 聚合物链占空间大（每条链在水中伸展开约 3.5 nm），会优先占据颗粒表面。当 PEG 覆盖密度达到临界值，新的脂质分子就再也插不进去了；PEG 链之间的空间位阻（steric repulsion，两个大分子互相挤占空间时产生的排斥力）限制颗粒进一步增大。
PEG-脂质含量越高，粒径越小；含量越低，粒径越大。通过调整 PEG-脂质的比例，可以把 LNP 的粒径精确控制在 60–150 nm 范围内。
第二是防止聚集。PEG 链在颗粒表面形成的亲水层产生空间位阻，阻止颗粒之间的相互靠近和融合。这在储存过程中尤其重要。没有 PEG-脂质的 LNP 在 4°C 储存几天就会出现明显的聚集和粒径增大。而含 PEG-脂质的配方可以在 -20°C 或 4°C（经优化后）稳定储存数月。
第三是延长体内循环。PEG 层构成一层水化保护层（stealth coating），减少血浆蛋白在颗粒表面的沉积。免疫系统清除异物依赖一套标记机制：血浆中的调理素（opsonin，比如补体蛋白 C3b 和免疫球蛋白）会粘附在异物表面。巨噬细胞通过识别这些粘附蛋白来吞噬异物。PEG 层形成一层光滑的水化屏障，让调理素难以吸附，巨噬细胞也就识别不到 LNP，从而延长了 LNP 在血液中的循环时间，增加了到达靶组织的概率。
PEG-脂质面临一个核心矛盾：它的保护作用和细胞摄取效率是对立的。PEG 层固然能防止颗粒被清除，但同时也阻碍了 LNP 与靶细胞膜的接触、融合和被细胞内吞。PEG 含量越高，颗粒越稳定、循环越久，但转染效率越低。这就是为什么 PEG-脂质的比例通常被限制在 1–2 mol%：再高就会明显影响递送效果。
解决这个矛盾的策略之一是PEG 脱落（PEG shedding）。PEG-脂质在体内并不是永久锚定在 LNP 表面的，它会逐渐从颗粒上脱落（转移到血浆蛋白或细胞膜上）。脱落速度取决于脂质锚的碳链长度：DMG-PEG2000 的脂质锚是 C14 链（二肉豆蔻酰基），锚定力弱，脱落快，半衰期约几个小时；DSPE-PEG2000 的脂质锚是 C18 链（二硬脂酰基），锚定力强，脱落慢。
BNT162b2 选用了 ALC-0159（一种 C14 锚的 PEG-脂质），正是看中它的快速脱落特性。注射后 PEG 层在数小时内大部分脱落，暴露出颗粒表面，促进细胞摄取和内体逃逸。而需要长时间循环才能到达肝脏的 IV 给药产品（如 Onpattro），则可能需要脱落更慢的 PEG-脂质。
PEG 还有一个更深层的问题：免疫原性。虽然 PEG 长期以来被认为是生物惰性的，但越来越多的证据表明，人体可以对 PEG 产生免疫反应。首次注射含 PEG 的纳米颗粒后，B 细胞可能被激活产生抗 PEG IgM 抗体。当第二次注射时，这些抗体与 PEG 结合，激活补体系统，导致 LNP 被快速从血液中清除，这被称为加速血液清除（accelerated blood clearance, ABC）现象。对于需要反复给药的治疗（如蛋白替代疗法、肿瘤免疫治疗），这是个需要解决的难题。
研究者正在探索 PEG 的替代方案：聚肌氨酸（polysarcosine, pSar）是目前最受关注的候选之一。它是一种聚 N-甲基甘氨酸，具有与 PEG 类似的亲水性和空间位阻效果，但免疫原性更低。动物实验显示，用 pSar 脂质替换 PEG 脂质后，LNP 的补体激活和促炎细胞因子水平大幅降低，同时体内 mRNA 递送效率不打折扣（Zhang 2024, Xu 2025）。其他替代方案包括聚甘油（poly(glycerol)）和聚噁唑啉（poly(oxazolines)）。这些替代聚合物目前还处于临床前研究阶段，距离实际应用还有距离，但方向是明确的。
LNP 常用脂质的化学结构汇总：可电离脂质（ALC-0315、SM-102、DLin-MC3-DMA、SA2-SC8、9A1P9）；PEG 化脂质（ALC-0159、DMG-PEG2000、DSPE-PEG2000、聚肌氨酸-脂质）；胆固醇及其衍生物（胆固醇、β-谷甾醇、7α-羟基胆固醇、20α-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇）；磷脂（DSPC、DOPE、DOPS、DOPG）。
四种脂质之间存在大量的相互影响和矛盾。改变任何一种脂质的类型或比例，都会牵连其他成分的表现。
一些具体的例子：
这意味着 LNP 配方优化本质上是一个多维优化问题。四种脂质、每种脂质有多种选择、加上比例的连续变化，组合空间是巨大的。传统的"逐一改变变量"（OVAT，one variable at a time）方法在这里效率很低，因为变量之间存在大量交互效应。更有效的策略是设计实验（Design of Experiments, DoE）结合高通量实验平台，一次平行制备和评估数十甚至上百个配方。
微流控高通量筛选平台一次实验可以筛 96 个配方，适合在这样多维的组合空间里做 DoE 筛选。
实验室中在细胞系上筛选出的"最优配方"不一定在动物体内表现最好，而动物体内的数据也不能直接外推到人体。LNP 进入血液后，表面会吸附血浆蛋白形成"蛋白冠"（protein corona）。这层蛋白冠的组成取决于物种、给药途径和 LNP 表面化学性质，它会重新定义 LNP 与细胞的相互作用。因此，从体外筛选到动物 PK/PD 再到人体临床的每一步转化都可能需要配方调整。
本文内容整理自：Raj Kumar (Ed.), Lipid Nanoparticle-based mRNA Delivery Systems, Academic Press (Elsevier), 2026, Chapter 4 §2 (Ushasi Das et al.) 和 Chapter 2 §3 (Soumarshi Das)。补充数据来源：Eygeris Y et al., Acc Chem Res 2022；Zhang Y et al., BMEMat 2024；Xu S et al., Mol Ther Methods Clin Dev 2025。