紫外分光光度法 · 第 8 篇
同一管 RNA 放进 TNE 缓冲液，A260 就比纯水低 16%（Wilfinger 1997）：样品没变，变的是它装进仪器的方式。比色皿材料、缓冲液成分、pH、离子强度、指纹、气泡，任何一环都能让 A 的绝对值或比值偏离 Beer-Lambert 公式给出的值。核酸纯度比值对这些条件最敏感，所以本篇的例子多来自 RNA。
一管 RNA 放水里读 A260/A280 是 1.5，换到 1 mM Na₂HPO₄ 缓冲液就跳到 2.0。还有人用塑料比色皿测 A260，读数和石英比色皿对不上。
选比色皿要看材料和光程。
材料的透光范围决定能不能用。按 Agilent primer 的数据，熔融石英可以透到约 190 nm，是 UV 区的首选；普通石英约 210 nm 开始截止。普通玻璃在 320 nm 以下强吸收，紫外区不能用。丙烯酸塑料在 300 nm 以下同样强吸收，还不耐多种有机溶剂。测 220 nm 以下的肽键吸收，玻璃和塑料都不行。
光程精度决定误差有多大。标准 10 mm 最常用，外部宽度 12.5 mm。优质比色皿的光程公差在 ±0.01 mm，覆盖 0.5–100 mm 的全范围。也就是说，两支标称 10 mm 的比色皿，实际光程可能差 0.02 mm，对应 0.2% 的系统误差。测标准和样品必须用同一支比色皿，就是为了消除这个变量。
光程的选择取决于样品浓度。高浓度样品用 1–2 mm 短光程，避免 A 超出线性区；极低浓度用 50–100 mm 长光程，把信号放大到可读范围；常规浓度就 10 mm。
反射损失容易被忽略：即使落在透光区，每支比色皿的几个界面合计也有约 10% 的反射损失。所以空白和样品不仅要"同材料"，两支比色皿最好经过配对校准（matched pair），让反射损失在相减时相互抵消。
图 1 · 四种常见比色皿材料的可用波长范围。熔融石英 190 nm 起透，普通石英 210 nm 起透，丙烯酸塑料 300 nm 以下不能用，普通玻璃 320 nm 以下不能用。底部标了五个常用波长（220 肽键 / 260 核酸 / 280 蛋白 / 340 NADH / 600 OD菌）对应哪种比色皿能用。
比色皿选对、光程控好之后，下一个问题来自装在比色皿里的液体。溶剂有自己的吸收截止，它决定了你能测的最低波长。
溶剂:UV 截止 (nm)
蒸馏水:<195
正己烷:~199
绝对乙醇:~207
甲醇:~210
氯仿:~246
DMSO:~270
丙酮:~331
读 220 nm 以下的肽键吸收，丙酮、DMSO、氯仿都不能用。测常规 A260/A280，蒸馏水、PBS、HEPES 都可以，但要注意 Tris 缓冲液本身在 UV 区有吸收，会限制可用波长范围。
Wilfinger 1997 举了一个具体例子。同一管 RNA，放在 TNE 缓冲液（10 mM Tris、1 mM EDTA、0.2 mM NaCl，pH 7.4）里，A260 读数比纯水降低 16%，吸收峰从约 260 nm 移到约 258 nm。所以缓冲液除了自身吸光，还会改变测到的峰形和峰位。用 260 nm 的 A 值换算浓度，这 16% 的偏差会直接带进结果。
缓冲液影响的不只是 A 的绝对值。在核酸定量里，更关键的指标是 A260/A280 这个比值。它是判纯度的常用标尺，经验值是纯 DNA 约 1.8、纯 RNA 约 2.0。这个比值对 pH 和离子强度很敏感，所以从水里读到的 1.5 未必是污染，也可能来自 pH 偏酸。
Wilfinger 1997 在 BioTechniques 上系统测量了 pH 和离子强度对这个比值的影响。
图 2 · 左：RNA 的 A260/A280 随 pH 变化，从蒸馏水（pH 5.4）的 1.5 升到 pH 8.0 的 2.0，pH 6.0–7.6 之间变化最陡。右：RNA 的 A260/A280 随 NaCl 浓度变化，从 0.1 mM 的 1.533 升到 1000 mM 的 2.129。两条曲线说明同一管 RNA 换溶剂就能读出不同的纯度。
Wilfinger 用 TRI Reagent 从冷冻大鼠组织提取 RNA，系统比较了不同溶剂里的光谱行为。
在 pH 约 5.4 的蒸馏水里，RNA 的 A260/A280 只有 ~1.5，远低于预期的 2.0。加 1–3 mM Na₂HPO₄ 把 pH 调到 7.5–8.5，比值升到 ~2.0。pH 一变，比值在 10–15 秒内就跟着变。pH 6.0–7.6 区间变化最陡，超过 8.0 后趋于平稳。
比值随 pH 上升，主要是因为 A280 随之下降。反过来，在酸性水里 A280 相对偏高，比值被压到 1.5 左右，样品未必有纯度问题。
DNA 同样受影响。水里（pH 5.4）A260/A280 约 1.4，换到 1 mM Na₂HPO₄（pH 8.5）后升到 1.7–1.8。所以"水里读 DNA 比值低于 1.7 就是蛋白污染"这条判据并不可靠，比值低也可能是 pH 造成的。
pH 不是唯一因素。Wilfinger 把 NaCl 从 0.1 mM 加到 1000 mM，RNA 的 A260/A280 从 1.533 升到 2.129。
盐增加时，A260 和 A280 的绝对值都下降，但 A280 降得更多，所以比值升高。KAc、EDTA 溶液也有类似的浓度依赖响应，说明这个效应不是 NaCl 特有的。
离子强度升高的代价落在定量上。Na₂HPO₄ >1 mM 时，A260 本身会 递减 4–12%，Wilfinger 称之为小幅下降。下面推荐的 1–3 mM 已在这个区间，所以它适合判纯度；用 A260 换算浓度时，要把这部分偏低考虑进去。
1–3 mM Na₂HPO₄，pH 8.0–8.5
这是 Wilfinger 原文推荐的核酸光谱评估可靠溶液。它的 pH 落在比值趋平区，小扰动不影响结果；Na₂HPO₄ 还可以用 DEPC 处理灭活 RNase，Tris 基缓冲液不能用 DEPC。
碱性条件下，蛋白污染也更容易被检出。Wilfinger 往 RNA 里加入大鼠肝粉蛋白，pH 8.5 下同样量的蛋白使 A260/A280 降低 26%，pH 6.0 下只降 7%；换成人血浆蛋白，结果相同。酸性水既压低了比值，也让蛋白污染造成的比值变化更小，容易漏检。
污染分物理杂质和化学残留两类，对策不同。
指纹油脂会在光学表面产生可读的吸光度，比色皿划痕会改变光路，气泡散射光会让表观 A 偏高。悬浮颗粒也散射光，小颗粒的瑞利散射强度 ∝ λ⁻⁴，所以低波长处受影响更大。过滤能去除散射，但微量样品过滤损失大，不一定可行。
微量比色皿还要做侧壁掩蔽。没做的话，光会绕过样品从侧壁直达检测器，读到的值不反映样品的吸收。
图 3 · 四个常见陷阱。指纹油脂让读数虚高；气泡散射光，造成 A 虚高；微量比色皿侧壁没掩蔽，光绕过样品，读数虚低；酚或染料等化学污染扭曲整个光谱。每一格左边是出问题的样子，右边是 A 读数怎么错的。
核酸制备后常见几种残留物在 UV 区有自己的吸收。提取用的酚在 270 nm 附近有强吸收。凝胶染料（EtBr、GelRed）在 UV 区也有吸收峰。去污剂（SDS、Triton）会和蛋白结合，从而改变光谱。
这些残留会叠加到样品信号上，要么拉高 A 值，要么扭曲比值；具体数值要查各自试剂厂商的技术文件。
无论哪类污染，空白必须用和样品相同的溶剂或缓冲液。单光束仪器上，空白和样品的读数间隔越短越好，避免灯漂移引入误差。找一个内部参比波长（分析物不吸收处），可以校正基线漂移。条件允许时，扫一下全光谱备查。
Wilfinger W. W., Mackey K., Chomczynski P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques 1997, 22(3), 474-481. · Owen T. Fundamentals of Modern UV-Visible Spectroscopy: A Primer. Agilent Technologies, 2000.