紫外分光光度法 · 第 7 篇
前几篇讲紫外定量：读一个波长下的 A，用 Beer-Lambert 算浓度。分光光度计还能读速率（酶动力学）和散射（OD600 浊度）。LDH 活性和 OD600 菌密度这两种用法实验室天天在用，读法却和静态吸收不同。前者在紫外区，后者在可见区；它们的可靠性分别建立在 Horecker 1948 的常数标定和 Koch 1970 的仪器对比上。
你做 LDH 活性测定，加底物后按 kinetics 启动，屏幕上 340 nm 吸收曲线开始缓慢下降。这时读的是 A 对时间的变化率 dA/dt，这就是酶动力学。周一早上接一管 E. coli，1:10 稀释后放进酶标仪读 600 nm，屏幕跳 0.48。你读的确实是 A，但 E. coli 菌液本身几乎不吸光，读数来自细胞对光的散射，这就是浊度测量。
把吸光度的用法摊开来看，主要有六种。每种读的物理量不同，典型场景也不同。
读法 / 读什么 / 典型用途
静态吸收 A:读什么 浓度;典型用途 蛋白、核酸、小分子
动力学 dA/dt:读什么 反应速率;典型用途 酶活、反应监测（本篇）
浊度 OD:读什么 散射强度;典型用途 菌密度、蛋白聚集（本篇）
差分光谱 ΔA(λ):读什么 构象/环境变化;典型用途 蛋白折叠、Tm
比率 A260/A280:读什么 纯度;典型用途 核酸污染
扫描 A(λ):读什么 全谱指纹;典型用途 未知物鉴定
其中动力学把 A 读成时间的函数，浊度把 A 当作散射强度的读数。
图 1 · 吸光度的六种读法。本篇聚焦标黄的动力学（读速率）和浊度（读散射）两种；其他四种（静态吸收 A、差分光谱、A260/A280 比率、全谱扫描）散布在系列其他篇章里。
用紫外测酶活，先要找一个只随目标反应变化、其他成分都不干扰的信号。NADH 正好提供了这样的信号。
NAD⁺ 在 340 nm 几乎不吸光，还原态 NADH 却有一个明显的吸收峰。所以反应未启动时 340 nm 读数稳定；反应启动后，A 随 NADH 的产生或消耗线性变化。这是一个干净的差分信号：只要其他试剂在这个波长不吸收，A 的变化就可以归因于 NADH，也就是反应本身。
目标酶不直接作用于 NAD 时，可以用酶偶联反应：把它的产物偶联到一个脱氢酶上，让 NAD(P)H 的氧化或还原成为可读信号，同样在 340 nm 追踪。
图 2 · 左：NADH 与 NAD⁺ 的紫外吸收光谱，260 nm 处两者差不多（都有腺嘌呤的吸收）。340 nm 却分出高下：NADH 有明显峰（ε = 6220 M⁻¹cm⁻¹），NAD⁺ 贴底，这就是干净的差分信号。右：酶偶联反应的三步流程，目标反应产物通过脱氢酶连到 NAD(P)H，把不吸光的反应变成 340 nm 的可读速率。
这个方法沿用至今，靠的是 NADH 在 340 nm 的 ε 值。算酶活时必须用到它，不同实验室想对比数据，更得用同一个 ε 值。
这个值来自 1948 年 Horecker 与 Kornberg 在 JBC 上发表的一篇短文。他们用三种独立的脱氢酶反应交叉测定 NADH 在 340 nm 的摩尔消光系数：丙酮酸-乳酸脱氢酶、乙醛-醇脱氢酶、异柠檬酸-异柠檬酸脱氢酶。三组数据算出的 ε 差异不到 2%，最终定值 6.22 × 10⁶ cm²/mol（即 6220 M⁻¹cm⁻¹，NADH，340 nm）。同期 Colowick 用果糖-1,6-二磷酸酶系统独立测得 6.3 × 10⁶，互相吻合。
仪器配置：Beckman model DU 石英分光光度计，1 cm 光程 Corex D 比色皿，340 nm 处狭缝 1.6 nm（原文记作 1.6 mμ，老单位 mμ 即纳米）。
Horecker 1948 这篇论文没有提出新方法，贡献是把一个 ε 值标得更准。从 1948 年起，生化界测 NADH 偶联反应有了统一的换算常数。今天在上海一个实验室测 LDH 活性，和 1950 年代在圣路易斯测的，可以直接对比。
速率法
固定温度、pH、酶浓度、底物饱和，反应速率正比于待测物浓度，从 dA/dt 换算活性。
终点法
选择条件让反应在 5–20 分钟内跑完，ΔA = A_final − A_initial 正比于底物总量。
Horecker 和 Kornberg 在原文里还演示了这种方法的检测下限：用 0.01 M 氨基脲捕获乙醛，把醇脱氢酶逆反应的平衡推到 95% 完成，最终可检测到 0.5 μg 乙醇。
条件要恒定，也要写清。25、30 或 37°C 下的反应速率差异明显，pH、缓冲液和底物浓度也都会影响，所以活性报告必须写清这四项。测定时所有底物要饱和，酶浓度固定。
还要扣除不依赖底物的本底氧化。高浓度 ADH 存在时，即使没加底物，NADH（原文记作 DPNH₂）也会缓慢氧化，20 分钟内吸光度持续下降。把这条缓慢下降当成"反应已启动"，就会读出一个假阳性速率，所以要做不加底物的空白对照。
开头那管菌液读出的 0.48 也叫 A，但和前几篇蛋白/核酸的 A 不是一回事。蛋白/核酸的 A 是分子实际吸收了光，菌液的 A 是细胞把光散射偏离了原方向。
细菌尺寸约 1 μm，和 600 nm（0.6 μm）的光波长相当。瑞利散射的 λ⁻⁴ 规律只适用于粒子远小于波长的情况。粒子尺寸和波长相当时，散射对波长的依赖变弱，不能再按 λ⁻⁴ 换算。
600 nm 下菌液几乎不吸光，所以到达检测器的光变少，原因就是细胞把光散射偏离了原方向。所以 OD600 这个"A"，读出来的其实是散射损失的总量。
1970 年，Koch 在 Analytical Biochemistry 发表了 "Turbidity Measurements of Bacterial Cultures in Some Available Commercial Instruments"。
样品是 E. coli strain B，养在葡萄糖 M9 培养基里，指数生长期（倍增时间 60 分钟）。离心、洗涤、干燥至恒重，建立 A 对 w（干重 mg/mL)的标准曲线。然后用当时实验室常见的四款仪器分别测同一批样品：Zeiss PMQ II、Cary model 16、Beckman DU + Gilford、Bausch & Lomb Spectronic 20。他要回答的问题是：同一管菌液在不同仪器上读出的数字，差距从何而来。
差距来自仪器的光学几何。理想浊度计要求光束完全平行、检测器孔径无限小，这样散射光完全进不了检测器。实际仪器的检测器总有一定接收角，部分散射光会"漏"回来。Koch 测得 Zeiss PMQ II 在常规配置下，只有 7% 的单次散射光被意外收回，读数达到理论值的 93%。
漏回的散射光在短波长处更多，所以仪器越偏离理想，A₄₂₀/A₆₀₀ 比值越低：
仪器:A₄₂₀/A₆₀₀ 比值
理论（Rayleigh-Gans 椭球）:2.22
Cary model 16:2.13
Zeiss PMQ II:2.06
Beckman DU-Gilford:1.97
Spectronic 20:1.59
Spectronic 20 的比值只有 1.59，因为它的检测器孔径大，在低波长处把大量散射光又收了回来，本该算进 A 的那部分又从 A 里减掉了。所以 Koch 反复强调：标准曲线不能套用别人的，必须在自己的仪器上校准。
图 3 · 左：光穿过菌液时会被细胞散射偏离原方向，仪器把到达检测器的光强降低记成 A，被散射偏离的光就被算成了吸收。右：A₄₂₀/A₆₀₀ 比值反映仪器几何，Spectronic 20 的 1.59 和理论值 2.22 的差距主要来自检测器孔径大，低波长处回收了本该偏离检测器路径的散射光。
常见的解释有两条：
两种读法各有局限。
抑制剂会让速率失真。速率下降可能是抑制剂占了底物或酶的活性位点，所以要和不加抑制剂的反应对比。无底物空白里也要加同样的抑制剂（纯缓冲液 + 酶 + 抑制剂，不加底物），才能把非酶促的 NADH 自发氧化单独扣除。
一是 A 和菌密度不是线性关系。这里讲的是菌液干重浓度，和前几篇蛋白/核酸定量里的"浓度"是两个不同的量。Koch 测到 A 还没到 0.4，曲线就已经弯了。Zeiss PMQ II、600 nm、1 cm 光程、E. coli strain B、葡萄糖 M9 的实际关系是：
A = 3.04w − 0.914w² (w 为菌液干重 mg/mL)
也就是 A = 1.0 对应约 0.37 mg 干重/mL。Beer-Lambert 在蛋白/核酸定量里成立的 A ∝ c，在 OD600 这里不适用，因为 OD600 读的是散射强度。高密度下还会发生多次散射（散过一次的光再被另一个细胞散回检测器），线性偏离更明显。
二是换一个条件，换算系数就得重测。不同菌株的细胞体积差异可达 7 倍；大细胞如 B. megaterium 与小细胞在低密度时初始斜率相同，但高密度时弯曲更明显。更换光电管，宽角仪器的标准曲线初始斜率可相差 20%。
此外，干重不等于活菌数。死细胞和碎片都会贡献散射，OD 只能给出一个估计值。要得到准确的活菌浓度（cfu/mL），仍需做平板计数。
Horecker B. L., Kornberg A. The extinction coefficients of the reduced band of pyridine nucleotides. Journal of Biological Chemistry 1948, 175, 385-390. · Koch A. L. Turbidity measurements of bacterial cultures in some available commercial instruments. Analytical Biochemistry 1970, 38, 252-259. · Owen T. Fundamentals of Modern UV-Visible Spectroscopy: A Primer. Agilent Technologies, 2000.