紫外分光光度法 · 第 4 篇
同一管纯化后的蛋白，A280 和 BCA 算出的浓度常常对不上，偏差的方向还因蛋白而异。实验室常用的方法有四种：A280 直接测紫外吸收，BCA、Bradford、Lowry 三种显色法。四种方法的物理/化学根基不同，选错了，读数会整体偏离真值。选哪种，取决于样品纯度、ε 是否已知，以及对速度和灵敏度的要求。
280 nm 的紫外吸收，主要来自蛋白里的三类结构：
这三类结构都有共轭电子，能在 280 nm 附近吸收紫外光。其他 17 种氨基酸在 280 nm 基本不吸收（苯丙氨酸 Phe 有一点弱吸收，但通常忽略）。这也解释了一个实验室常见现象：如果一个蛋白里没有 Trp 和 Tyr，它在 280 nm 就没有峰（典型例子：胶原蛋白、明胶。Stoscheck 1990 的图里明胶在 280 nm 几乎是平的）。
图 1 · Trp 吲哚、Tyr 苯酚、Cys-Cys 二硫键三个吸光基团的化学结构。右侧饼图按 20 Trp + 40 Tyr + 16 cystine 这组示意整数拆分 ε₂₈₀ 贡献：Trp 主导（约 64%）、Tyr 占三分之一（35%）、cystine 不足 2%。这组整数合计约 171,600 M⁻¹·cm⁻¹，低于按 E1% 13.7、150 kDa 换算的约 205,500。真实 IgG 的 Trp 和 Tyr 更多，饼图只示意各基团的比重。
A280 本身只是一个读数。要把读数换成浓度，要用 Beer-Lambert 定律：
c = A / (ε · b)
b 是光程，A 是测出来的吸光度，ε 是摩尔吸光系数，也就是这个蛋白在 1 mol/L 浓度、1 cm 光程下的 A280 值。
每个蛋白的 ε 不一样（含多少 Trp、多少 Tyr 都不同）。从序列算出 ε 的通用公式，花了 28 年、三代人的工作才定型。
Harold Edelhoch 用两个模型化合物：N-乙酰基色氨酸酰胺（N-Ac-Trp-NH₂）和三肽 Gly-Tyr-Gly，都放在 6 M 盐酸胍里变性展开。这样单个残基的 ε 就只由侧链本身决定，不受蛋白构象影响。
Edelhoch 定出来的数字：Trp = 5690、Tyr = 1280 M⁻¹·cm⁻¹。但模型化合物毕竟不是真蛋白，实际蛋白里残基之间有相互作用，周围的电荷环境、氢键都可能让 ε 略有变化。Edelhoch 给的是单残基底线。
Harry Mach 换了思路：自测 32 个已知序列蛋白的消光系数，连同文献值共 81 个值，再用矩阵解卷积方法回归出"平均意义上"的 Trp 和 Tyr 的 ε。这项工作同时处理了一个实际问题：怎样把 A280 读数里的光散射成分扣除。Mach 用 330 nm 的读数做散射基线，因为蛋白在 330 nm 几乎无吸收。
数字变成 Trp = 5540、Tyr = 1480 M⁻¹·cm⁻¹，和 Edelhoch 的模型化合物值相比略有修正。
Nick Pace 把样本量扩到 80 个蛋白、116 个独立 ε 实测值，还把此前一直忽略的二硫键 (cystine) 贡献也算进来。最终的公式：
ε₂₈₀ = 5500 · n(Trp) + 1490 · n(Tyr) + 125 · n(cystine) M⁻¹·cm⁻¹
这就是今天 ExPASy ProtParam、Biopython、EMBOSS 这些"从蛋白序列算 ε"的工具背后用的那条公式。
你有一个蛋白序列，数一下里面多少 Trp、多少 Tyr、多少 cystine（氧化后的二硫键，不是游离 Cys），代进公式就能得到 ε₂₈₀。再除以分子量，得到 (mg/mL)⁻¹·cm⁻¹，也就是生物实验室最常用的"A280 × 多少 = mg/mL"里那个系数。
蛋白 / 分子量 / A(1%, 1 cm) / A280 ≈ ? 对应 1 mg/mL
BSA（牛血清白蛋白）:分子量 66 kDa;A(1%, 1 cm) 6.3;A280 ≈ ? 对应 1 mg/mL 0.63
IgG（典型抗体）:分子量 150 kDa;A(1%, 1 cm) 13.7;A280 ≈ ? 对应 1 mg/mL 1.37
卵清蛋白:分子量 45 kDa;A(1%, 1 cm) 7.0;A280 ≈ ? 对应 1 mg/mL 0.70
所以纯化完一管 IgG 样品，测到 A280 = 0.685，除以 1.37，就是 0.5 mg/mL。整个过程不需要加试剂、不需要孵育、不需要标准曲线。
方法看起来简洁，但有三个场景会失效。
胶原蛋白、明胶就是典型例子。这类蛋白 A280 几乎测不出来。遇到这种情况，A280 不能用，需要转其他方法（见后文的显色法，或者用 A205 测肽键吸收）。
细胞裂解液、大肠杆菌可溶部分、纯化早期的上清，这类样品里蛋白和核酸混在一起。核酸的吸收峰虽然在 260 nm，但 280 nm 处也还有相当的吸收，直接 A280 测出来的数字会偏高。
校正办法是 Warburg-Christian 双波长公式（Groves 1968 修正版）：
mg/mL = 1.55 × A280 − 0.76 × A260
这条公式同时读 280 和 260，把核酸贡献的那部分减掉，只留蛋白。适合粗样品的快速估算。中国药典 2025 年版通则 0731 第六法写的是另一组系数：1.45 × A280 − 0.74 × A260。两组系数来源不同，按 ChP 放行时用 0731 的系数；研发阶段两组都常见，同一个项目里固定用一组。
样品如果有蛋白聚集、纳米颗粒、气泡，会造成散射，检测器会把它当成吸收记下来。判断方法：测 A330。所有蛋白在 330 nm 几乎无吸收，读数明显高于零就说明有散射，需要过滤或用校正公式：
A280（真） = A280（测） − 1.929 × A330
330 nm 做散射基线的思路来自 Mach 1992;1.929 是 Pace 1995 按 Rayleigh 散射的 λ⁻⁴ 规律，把 330 nm 的散射外推到 280 nm 用的因子。
A280 的这三个盲点，显色法正好能填上。
显色法的核心思路：蛋白自己在 280 nm 的吸收要么不够强、要么测不出来，通过一个化学反应把它转化成一个染料或络合物的强吸收。染料/络合物的 ε 常在 10⁴–10⁵ 量级，比蛋白自己的 A280 灵敏 1-2 个数量级。
Smith 1985 年发表，现在是实验室最主流的显色法。
机理（两步一锅反应）:
参数:
主要干扰：还原剂（DTT、β-巯基乙醇会直接把 Cu²⁺ 还原）、EDTA（螯合 Cu）、高浓度还原糖。
Bradford 1976 年发表，特点是快。
机理：考马斯亮蓝 G-250(CBB G-250)染料在酸性条件下本身是红棕色，λ_max 在 465 nm。和蛋白结合后，染料被稳定在阴离子形式，λ_max 红移到 595 nm，溶液呈蓝色。
参数:
几个限制:
1951 年 Lowry 发表，是三种显色法里最老的，也曾是生化实验室最常用的显色法。
机理（两步）:
参数:
干扰清单长：酸（HCl / TCA / PCA）、还原剂（DTT / ME）、EDTA、酚类、高浓度去垢剂。几乎每一个缓冲液组分都要查一下兼容性。
Lowry 在 BCA 出现后逐渐被取代。BCA 做的是同一件事（都靠 Cu²⁺ → Cu⁺），但试剂稳定、一步法、干扰少、蛋白间变异更小。今天实验室还在用 Lowry，多半是历史 SOP 沿用，或者法规文件里直接写了"Lowry 法"。
维度 / A280 / BCA / Bradford / Lowry
量程:A280 20–3000 µg;BCA 0.2–50 µg;Bradford 0.2–20 µg;Lowry 2–100 µg
读取波长:A280 280 nm;BCA 562 nm;Bradford 595 nm;Lowry 750 nm
反应时间:A280 立即;BCA 30 min / 60°C;Bradford 5 min / 室温;Lowry ~40 min
蛋白间变异:A280 大（依赖 Trp/Tyr）;BCA 小;Bradford 中（依赖 Arg）;Lowry 大
主要干扰:A280 核酸、散射;BCA 还原剂、EDTA;Bradford 附壁、Arg 少;Lowry 酸/还原剂/EDTA/酚
何时选:A280 ε 已知 + 要快;BCA 粗样品 + 去垢剂;Bradford 快速筛查;Lowry 历史 SOP 沿用
表中的量程取自 Stoscheck 1990 的经典比色皿方法。它按每次检测所用的蛋白总量（µg）计，折成浓度还要看比色皿或孔的体积。表最后一行落到具体样品上是这样：
图 2 · 四种蛋白定量方法在量程、读取波长、反应时间、蛋白间变异、主要干扰、适用场景六个维度的对比。底部给出按样品类型的实操判断。
A280 本来就是四种方法里最快的。
但在经典紫外分光光度计上，每管要换比色皿、做缓冲液空白、读数、擦拭比色皿，单样周转 1-2 分钟。一板 96 个样品走完，一个人要半天。
微量板式紫外仪省掉了换皿和擦拭。Lunatic 单板 96 通量，每孔 2 µL 样品，几分钟读完全板，读数出来时按设定的 E1% 自动算浓度（选内置分析物，或输入按 Pace 公式算好的 E1%）。整个操作只有"上样 → 点击读数"，复检就是再上一次样。
这种设计把 A280 方法原本的两个麻烦（单样操作、手动换算浓度）一起去掉，让 A280 回到"一个样品几秒钟"的速度。显色法的灵敏度优势依然存在，但对"已知 ε 的蛋白"工作流（比如抗体纯化、重组蛋白生产），A280 + 微量板的组合省掉了显色法的加试剂和孵育步骤。
Edelhoch H. Spectroscopic Determination of Tryptophan and Tyrosine in Proteins. Biochemistry 1967, 6(7), 1948-1954. · Mach H., Middaugh C. R., Lewis R. V. Statistical Determination of the Average Values of the Extinction Coefficients of Tryptophan and Tyrosine in Native Proteins. Anal. Biochem. 1992, 200, 74-80. · Pace C. N., Vajdos F., Fee L., Grimsley G., Gray T. How to Measure and Predict the Molar Absorption Coefficient of a Protein. Protein Sci. 1995, 4, 2411-2423. · Stoscheck C. M. Quantitation of Protein. Methods Enzymol. 1990, 182, 50-68. · Smith P. K. et al. Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid. Anal. Biochem. 1985, 150, 76-85. · Bradford M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 1976, 72, 248-254. · Lowry O. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. J. Biol. Chem. 1951, 193, 265-275. · Groves W. E., Davis F. C. Jr., Sells B. H. Spectrophotometric Determination of Microgram Quantities of Protein without Nucleic Acid Interference. Anal. Biochem. 1968, 22, 195.