紫外分光光度法 · 第 3 篇
做蛋白纯化的人一天要看几十次 A280。这个数字来自一条光路：光从光源发出，经过光栅挑成单色，穿过样品里的蛋白，最后由光电二极管转成屏幕上的数字。整个过程几秒钟、几厘米，但这条链上任何一环出了问题，都会直接反映在 A 值上。
所有紫外仪，不管多贵、多便携，内部只串联四件事：
这四件事的顺序可以微调（扫描式是"分光 → 样品 → 检测",二极管阵列式是"样品 → 分光 → 检测"），但事情本身一件不少。
图 1 · 四件事串成一条光路。扫描式先挑波长再过样品（PMT 逐点扫描），二极管阵列式先过样品再分光到阵列（Lunatic / Stunner）。都校准到位时，读数可对齐。
紫外可见光谱从 190 nm 到 800 nm，跨越 600 多纳米。没有单一光源能在整段都亮得又稳又均匀，所以实验室紫外仪在光源上走过几条不同的路线。
这是经典双光束仪的配置：
光源 / 覆盖范围 / 主要供给
氘灯（D₂ lamp）:覆盖范围 190–400 nm;主要供给 紫外段
钨卤素灯（W-halogen）:覆盖范围 320–3500 nm;主要供给 可见光 + 近红外
整个紫外段（A280 / A260 / A340）靠氘灯；可见光段（OD600、BCA 显色）靠钨灯。两盏灯在 320–400 nm 之间有重叠区，仪器在这段内的某个波长自动切换。切换的那一瞬间，光强会有一次小小的阶跃。高端仪器靠双光束结构（一路过样品、一路作参比）把这个阶跃抵消掉，让基线在切换点上看不出波动。
氙灯是脉冲光源：每次放电产生一个短而强的宽谱光脉冲，一次闪光就给出约 190–1100 nm 全段的能量。本质上不存在紫外灯和可见灯切换的问题，也就没有切换点上的基线不连续。
实际用起来有这些好处：
代价是光源驱动电路更复杂、整体成本更高。Lunatic 用的就是氙灯：板上的孔逐个测量，每次闪光后所有波长同时到达 PDA 检测器。
不同波长的 LED 各一颗，按需点亮。结构紧凑、功耗低、寿命长；缺点是 LED 只能给出离散的几个波长，做全光谱扫描受限，更适合固定波长的场景。
三种方案各有场景。两盏灯是实验室级老仪器的标准配置；氙灯让微量板式仪（Lunatic、Stunner）能做快速扫谱；LED 阵列主要在便携仪器里出现。光源和检测器往往配套出现，氙灯和 PDA 就是当前微量紫外仪最常见的组合。
光源发出的是复合光（氘灯输出覆盖整段紫外），直接打到样品上，A280 的读数就会混入 260、300、340 等波长的信号。所以光源之后必须放一个单色器(monochromator)，从复合光里挑出想要的那个波长。
单色器的核心元件是光栅(grating)。光栅上刻着每毫米几百到几千条平行的细槽，不同波长的光照到光栅上，会以不同角度衍射出去。只要旋转光栅角度，就能让目标波长正好落到出口狭缝上。狭缝窄，挑出的波长就纯，但通过的光少。
挑出来的光有一个光谱带宽(Spectral Bandwidth,SBW)。SBW 是单色器实际输出的波长范围，不是严格的一个点。1 nm SBW 意味着设置 280 nm 时，实际是 279.5–280.5 nm 的光混在一起。做蛋白和核酸常规定量，1–2 nm SBW 足够；测精细光谱结构（比如二阶导数法）才需要 SBW ≤ 0.5 nm。
光栅有两种刻法：刻划光栅(ruled)和全息光栅(holographic)。后者是激光干涉刻蚀出来的，杂散光更低，现代高端仪器普遍用全息。
光挑好了，接下来要让它穿过溶液。样品池的构型主流有三种。
标准 10 mm 石英比色皿（紫外区必须石英，玻璃吸 UV），两手捏着对角线放进样品舱。经典双光束仪的默认配置。每次测量手动换皿，样品量 1–3 mL，动态范围有限，但光程定义最标准。
两个金属基座之间靠液体表面张力撑起一根 1 mm 的光柱，上下各连一条光纤。上样 1–2 µL，读完擦干，无需耗材。
液滴柱式光程在常规样品上是准确的，前提条件包括：
满足这些条件时，核酸和蛋白常规定量够用。
但它的误差来源多于比色皿，而且多为系统误差，重复测量取平均也消不掉：
微流控板式把光程刻蚀在芯片里固定不变，绕过了液滴形态带来的这类偏差。
Unchained Labs 的 Lunatic 和 Stunner 走的这条路。一块微流控芯片上刻着固定光程的测量腔，每孔 2 µL,96 孔并行，几分钟读完全板。光程由微流控刻蚀精确定义。Lunatic 的单孔板是 0.5 mm；双孔板（Lunatic 和 Stunner 通用）是 0.1 mm 和 0.7 mm 两条光路。出厂前每一块芯片都做过光程校正。
构型 / 光程 / 典型样品量 / 通量
比色皿:光程 10 mm;典型样品量 1–3 mL;通量 手动一次一个
液滴柱:光程 1 mm;典型样品量 1–2 µL;通量 手动一次一个
微流控板:光程 0.1 / 0.5 / 0.7 mm;典型样品量 2 µL;通量 96 孔并行
三种构型本质是同一件事：让光以固定光程穿过溶液。A = ε · c · b 里的 b 就是这个光程，只要 b 精确，不管构型，结果都能换算、对齐。
图 2 · 三种样品池构型。比色皿 10 mm 定义最标准，液滴柱 1 mm 省耗材但误差系统性，微流控板 0.1 / 0.5 / 0.7 mm 固定刻蚀且 96 孔并行。b 精确就能换算对齐。
光穿过样品，剩下的问题是怎么把光强度转成电信号。主流有两种技术。
历史悠久、灵敏度高，一个光子进去，电子倍增几百万倍出来。在分光光度计里，PMT 每次只接收一个波长的光，所以用它的仪器普遍是扫描式。单色器一次挑一个波长，样品透过的光打到 PMT；然后光栅转一个角度测下一个波长，逐点扫。扫完 200–800 nm 要几分钟。
几百到上千个微小二极管一字排开，对应不同波长。光不用一个一个扫，一次打过来，整个阵列同步读数，一次拿到全光谱。以 Lunatic 为例，它的波长范围是 230–750 nm，从上样到出全谱只要几秒。
Lunatic 和 Stunner 都用 PDA。Stunner 能在同一次测量里算出抗体药物偶联物（ADC，antibody-drug conjugate）的 DAR。DAR 即药物与抗体的摩尔比（drug-antibody ratio）。算它靠的是 PDA 一次拿全谱后跑 Unmix 解卷积，把抗体、药物连接子、浊度散射的贡献从混合信号里分开。这类仪器的典型光路是样品在前、光栅在后。光源发出的复合光先穿过样品，再经过光栅把各波长分散到 PDA 阵列的不同像素上。
扫描式和 PDA 式各有适用场景：前者在单波长高精度测量上仍是金标准（药典里一些药物成分的测定就靠它），后者胜在速度和通量。两种仪器只要都校准到位，读数同样能对齐。
上面拆完四件事，每件都依赖精确校准。光源要有稳定亮度、波长要对得准、光程要刻蚀到位、检测器要在工作区内线性。这些校准都追溯到药典规定的物理标准物。
A 的定义(log₁₀(I₀/I)，无量纲的对数比)意味着：只要两件事做到位，读数就有物理根基。
这两件事对应药典里的几项核心校准：波长、杂散光和吸光度准确度。
药典 / 用什么 / 参考点数
美国药典 USP ⟨857⟩:用什么 氧化钬（Ho₂O₃）的高氯酸溶液，也可用钬玻璃;参考点数 14 个吸收峰
欧洲药典 Ph.Eur. 2.2.25:用什么 高氯酸钬溶液，或氢灯/氘灯、汞灯谱线;参考点数 按表 2.2.25.-1 选点
中国药典 ChP 0401:用什么 汞（Hg）灯、氘灯、钬玻璃、高氯酸钬溶液，四者可选;参考点数 汞灯 11 条发射线
这些标准物在什么波长有吸收或发射，物理上是不变的。把仪器对着它们测，和数据库里的"真值"对比，偏差超过允差就是校准不合格。USP 的允差是 UV ±1 nm、可见 ±2 nm，EP 可见区放宽到 ±3 nm。每台出厂前、每次定期维护都做一遍这项。
杂散光是非目标波长的光漏到检测器，在高 A 区会让吸收曲线明显下弯。药典规定用特定盐溶液测杂散光强度：200 nm 附近常用 KCl,220 nm 附近用 NaI。ChP 0401 点名的是碘化钠（220 nm）和亚硝酸钠（340 nm）。
核心原则是 A 越高，对杂散光的容忍度越紧。在常规工作区（A 大致 1.5 以下）容忍度相对宽；要在 A > 2 区间测量，就得靠专门设计的杂散光抑制技术。具体阈值公式和测试方法在 USP ⟨857⟩ 里有明细条款，仪器厂商出厂前必须通过。
吸光度准不准，用重铬酸钾溶液检定：在规定波长测吸光度，算出吸收系数，再和药典给的许可范围比。ChP 0401 的许可范围表，列在本系列讲中国药典的那篇文章里。
98–102% 和 R ≥ 0.995 这两个数常被当成仪器指标。它们出自 USP 的方法验证部分，管的是分析方法；EP 2.2.25 和 ChP 0401 都没有规定这些。
Lunatic、Stunner、比色皿双光束仪、液滴柱式微量仪，都是这套校准体系的不同实现。核心物理和校准标准都一致，每个数字最终都追溯到氧化钬、重铬酸钾或汞灯那几个波长。
所以一个 A280 = 0.67 的读数，背后是一条链。氘灯（或氙灯）发光，光栅挑出 280 nm，石英或微流控光程精确定义，光电二极管转成数字。每一环都对着药典的物理标准校过。
现实里，同一样品在不同场合、不同仪器上读数偶尔会有小差异。常见原因是样品状态（气泡、颗粒、分层）、缓冲液背景、上样体积的重复性，以及比色皿或微流控板的清洁度。仪器本身的校准有明确允差，比如紫外区波长 ±1 nm，出厂和定期维护都要核对。
Owen T. Fundamentals of Modern UV-Visible Spectroscopy. Agilent Technologies, 2000, Chapter 2. · Desjardins P., Conklin D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. 2010, 45, e2565. · USP ⟨857⟩ Ultraviolet-Visible Spectroscopy. USP38-NF33. · Ph. Eur. 2.2.25 Absorption Spectrophotometry, Ultraviolet and Visible. 7th Edition, 07/2008:20225. · 中华人民共和国药典 2020 年版四部通则 0401 紫外-可见分光光度法（2025 年版所列值与之一致）. · Unchained Labs Lunatic / Stunner specification.