紫外分光光度法 · 第 1 篇
1666 年，瘟疫让剑桥大学停课。23 岁的牛顿回到家乡，在暗室里用三棱镜把阳光分出一道彩虹。牛顿给这道彩虹取名 spectrum，人类第一次意识到，白光是可分的。但牛顿那道彩虹其实没完。紫色再往外一段，还有他看不见的光，我们今天叫它紫外。
生物定量习惯用的紫外可见范围是 200–800 nm。下界受空气中的氧气限制，上界是惯例，参考的是水的吸收和检测器响应；生物分子偏偏在紫外段吸光，是因为这段光子的能量正好对上它们的电子跃迁。
牛顿的棱镜把白光分开，但他用眼睛看到的，只有波长 400–700 nm 那一段：可见光。
玻璃棱镜同样会把近紫外和近红外色散开，只是人眼看不见。真正的"光谱"比可见光宽得多。
1865 年麦克斯韦（Maxwell）从自己的方程组推出光是电磁波：电场和磁场会结伴传播，传播速度就是光速。
电磁波谱（electromagnetic spectrum）按波长从长到短排，从无线电波一路走到 γ 射线。可见光只是中间极窄的一段。
区段 / 波长 / 常见来源
无线电波:波长 > 1 m;常见来源 AM / FM / 蜂窝基站
微波:波长 1 mm – 1 m;常见来源 微波炉、雷达、Wi-Fi
红外:波长 700 nm – 1 mm;常见来源 遥控器、热成像
可见光:波长 400 – 700 nm;常见来源 太阳、灯
紫外:波长 100 – 400 nm;常见来源 太阳、紫外灯
X 射线:波长 0.01 – 10 nm;常见来源 CT、晶体衍射
γ 射线:波长 < 0.01 nm;常见来源 放射性核素
在整个电磁波谱里，人眼能看到的只是极窄的一段。这一段正好是穿过大气层、抵达地面强度最高的波段，即 400–700 nm。
紫外是可见光再往短波长走的一段。眼睛看不见，但光子能量更高，这是紫外分光光度法的物理基础。
图 1 · 电磁波谱全景，对数刻度从 1 pm 到 100 m,14 个数量级。紫外+可见光只占中间极窄的一小段，就是本系列覆盖的工作区（amber 框）。
日常说的"紫外"不是一整片。按它对生物和大气的不同影响，通常再分成三段：
紫外细分 / 波长 / 地球大气是否透过 / 生物效应
UVA:波长 315–400 nm;地球大气是否透过 大部分到地面;生物效应 皮肤晒黑、老化
UVB:波长 280–315 nm;地球大气是否透过 部分到地面;生物效应 晒伤、维生素 D 合成、DNA 损伤
UVC:波长 100–280 nm;地球大气是否透过 被臭氧层完全吸收;生物效应 强烈杀菌（胸腺嘧啶二聚体）
真空紫外 VUV:波长 < 190 nm;地球大气是否透过 不到地面;生物效应 空气本身就吸收
表里的真空紫外和 UVC 有重叠：它不是另起的一段，指的是 UVC 短波端连空气都会吸收的那部分。太阳紫外到地面的只有 UVA 和部分 UVB。UVC 虽然能量最高，但在同温层被臭氧（O₃）吸收殆尽，到不了地面。
实验室用的 UVC 灯（254 nm）是人造光源，用于灭菌。254 nm 光子的能量足以让 DNA 里相邻的两个胸腺嘧啶形成二聚体，干扰复制。这是它的杀菌机制，也是不戴护目镜看 UVC 灯会伤眼的原因。
紫外分光光度计覆盖的紫外段大致在 190–400 nm，生物定量常用的是 200 nm 以上，横跨 UVC、UVB、UVA 三段。测蛋白的 280 nm 属于 UVB，测核酸的 260 nm、测肽键的 205 nm 属于 UVC。再往短，就进入真空紫外（VUV）：空气中的氧气（O₂）开始吸收光子，普通仪器穿不过去。所以常规紫外仪器的下界在 190 nm 附近：限制来自光路上的空气，检测器再好也绕不过去。
紫外分光光度法习惯说的范围是 200–800 nm。这两个数字的来历要分开看。
前面说过，190 nm 以下氧气强吸收，仪器的紫外段因此止于 190 nm 附近。做生物定量习惯从 200 nm 起算，离这道极限留了一点余量。
想再往下，要么换成真空紫外仪（贵、慢），要么改用氮气吹扫。常规实验室不这么做，所以 A205 测肽键已是常用紫外定量波长里最短的。
往长波走，跨过可见光就进入近红外（NIR）。水分子里的 O–H 键通过伸缩振动和弯曲振动吸收光子，在 NIR 区出现一连串"振动泛音"吸收峰。它们在 760 nm、970 nm、1200 nm、1450 nm、1940 nm 附近各有一簇。
800 nm 是常规紫外仪的惯用上限：再往长，水的背景吸收逐渐变强，硅基光电二极管的响应也从 1000 nm 附近开始下降。更长的波段要用专门的近红外光谱仪。所以两端的性质不同：下界受空气吸收所限，上界 800 nm 是惯例，依据是水的吸收和检测器响应。
只有光子的能量正好对上分子某个能级跃迁的能级差，光才会被吸收。这背后是 1900 年 Planck 提出的能量量子化假设。
光子的能量由波长决定：
E = hν = hc / λh 是 Planck 常数，c 是光速，λ 是波长EeV = 1240 / λnm实用换算：每个光子的能量用电子伏（eV）
波长 / 区段 / 光子能量
205 nm:区段 UVC;光子能量 6.05 eV
260 nm:区段 UVC;光子能量 4.77 eV
280 nm:区段 UVB;光子能量 4.43 eV
340 nm:区段 UVA;光子能量 3.65 eV
400 nm:区段 紫;光子能量 3.10 eV
600 nm:区段 橙;光子能量 2.07 eV
800 nm:区段 近红外边界;光子能量 1.55 eV
这些数字本身不好记。但把它们和对应的分子事件做个对比，就能看出紫外这段为什么特别重要。
室温下分子的热运动能量 kT ≈ 0.026 eV。从 280 nm 到 205 nm，光子能量是它的 170–230 倍。
一个 C–C 键的断键能约 3.6 eV,C–H 键约 4.3 eV。280 nm 光子的能量（4.43 eV）已经和 C–H 键断键能相当。但吸收不等于断键，因为吸收是"共振激发"：能量进入一个精确匹配的电子跃迁，不会随机分散到各个化学键上。
真正能配对的，是分子里的电子跃迁能级差:
紫外光子的能量，和生物分子中共轭双键、芳香环的电子跃迁能级差，刚好匹配。含碳的共轭结构，只要在一定大小以上，吸收就会落进 200–400 nm。而生物体内最重要的两类分子（蛋白的芳香氨基酸、核酸的碱基）都满足这个条件。
图 2 · 紫外四个关键波长（205 / 260 / 280 / 340 nm）对应的光子能量，以及四种代表性生物分子结构和跃迁类型。底部示意：吸收的物理本质是电子从 HOMO 跃迁到 LUMO，光子能量等于能级差。
从牛顿的棱镜到今天的紫外可见分光光度计，中间经过这几个节点：
Newton I. A New Theory about Light and Colours. Philosophical Transactions 1672, 80, 3075–3087. · Owen T. Fundamentals of Modern UV-Visible Spectroscopy. Agilent Technologies, 2000, Chapter 1. · Mayerhöfer T. G., Pahlow S., Popp J. The Bouguer-Beer-Lambert Law: Shining Light on the Obscure. ChemPhysChem 2020, 21, 2029–2046. · ISO 21348:2007. Space environment — Process for determining solar irradiances.