为什么定量绕不开紫外

紫外分光光度法 · 第 0 篇 · 导论

为什么定量绕不开紫外

提完质粒测 A260 算 DNA、纯化完蛋白测 A280 算浓度、养菌时测 OD600 看密度。核酸、蛋白、菌液这三类最常见的场景，用的是同一套方法。在微量仪器上，一次只用 2 µL 样品，几秒钟就出数。

紫外到底在测什么、为什么 2 µL 就能出数、局限又在哪里，都要回到分子吸光的原理上。

• 200–800 nm — 生物定量常用波段
• 1729 → 1913 — 定律定型的历史跨度
• 2 µL — 微量仪器典型上样
• 8 大 — 覆盖的实验室定量场景

实验室的三种日常

场景一，发酵培养。菌液摇到下午，要判断继续摇还是已经到了接种密度。实验台上的微量紫外仪，2 µL 一滴，几秒钟后屏幕跳出 OD600 = 0.83，够不够接种当场就能定。

场景二，质粒提取。菌摇完、试剂盒柱子过完，要知道提到的 DNA 够不够下一步用、有没有蛋白或苯酚污染。2 µL 上到 Lunatic 板，A260 = 0.6，换算 30 ng/µL，A260/A280 比值 1.85，浓度够用、纯度合格。

场景三，抗体纯化。Protein A 柱收下来一排管，每管 2 µL 测 A280。人 IgG 在 1 cm 光程下消光系数约 1.37 (mg/mL)⁻¹，读数除以 1.37 就是 mg/mL。一排管很快测完，浓度高的合并冻存，稀的丢掉。

三个场景看着不同，共同的是：几秒钟出一个直接能用的数，三个场景都不用试剂，也不用标准曲线。

图 1 · 紫外分光光度法的三种日常。液滴柱式微量仪测核酸，Lunatic 板式 96 孔并行测蛋白，96 孔板读 OD600 看菌液浊度。同一个方法，三种规模。

它到底在测什么

仪器让一束光穿过溶液，记下它被吸收了多少。

溶液里的分子吸收特定波长的光，吸收多少，和它们的浓度成正比。整个定量的逻辑就这一条。

为什么蛋白测 280 nm，核酸测 260 nm？吸收波长由分子结构决定：

• 蛋白里的色氨酸（Trp）吲哚环、酪氨酸（Tyr）酚环，都是芳香结构，环里的电子吸收 280 nm 附近的光。
• DNA 和 RNA 里的嘌呤、嘧啶碱基，是共轭环结构，吸收 260 nm 附近的光。
• NADH 吸收 340 nm，叶绿素吸收 665 nm。

只要分子里有共轭双键或芳香环，就通常在 200–800 nm 有特征吸收。而生物大分子（蛋白、核酸、辅酶、代谢产物）几乎都满足这个条件。这是紫外定量应用范围广的根本原因。

一张全景：紫外能测什么

不止蛋白和核酸。按实验室里的常见场景分类，至少八大类：

场景 / 波长 / 测的是什么 / 实际怎么用

蛋白定量（A280 法）:波长 280 nm;测的是什么 Trp、Tyr、二硫键;实际怎么用 算 ε，读 A280，直接出浓度

蛋白定量（A205 法）:波长 205 nm;测的是什么 肽键;实际怎么用 不依赖芳香氨基酸，对"没有 Trp"的蛋白友好

核酸定量:波长 260 nm;测的是什么 嘌呤 + 嘧啶;实际怎么用 微量仪读 A260，乘因子（dsDNA 50、RNA 40）

核酸纯度:波长 260 / 280 / 230 nm;测的是什么 蛋白、苯酚、盐污染;实际怎么用 比值法看干净程度

酶动力学:波长 340 nm;测的是什么 NADH / NADPH;实际怎么用 跟踪辅酶消长，反算酶活

菌液:波长 600 nm;测的是什么 细菌散射;实际怎么用 OD600 估细胞密度

显色蛋白定量:波长 562 / 595 / 750 nm;测的是什么 蛋白和染料 / 铜离子复合物;实际怎么用 BCA / Bradford / Lowry 比色

小分子药物:波长 各特征峰;测的是什么 药物本身的紫外吸收;实际怎么用 对照品比较法（药典标准）

表里只有显色法要加试剂、做标准曲线，其余几项都直接读吸收。这张清单还偏保守，没算上 Tm 熔解曲线、DNA 高温变性、辅酶 Q 还原态监测这些更专门的场景。

图 2 · 从 205 nm 到 750 nm，生物实验室最常用的八大波长节点。上下交错的标签按分类色区分蛋白（橙/蓝/橙红/绿）、核酸（青绿）、辅酶（紫）、菌液散射（绿）。

表中的场景各用各的波长和换算方式，背后都是同一个吸光原理。

它为什么至今没被替代

紫外不是新方法。1729 年 Bouguer 研究光通过介质的衰减，1852 年 Beer 把浓度写进了公式。1913 年 Luther 给出今天课本上的 A = εcb。110 多年过去，这条公式没换过。

它至今还在生物实验室天天用，靠的是速度和样品量。

• 速度上，单次测量几秒钟，上样就能读。除了显色法，不需要标准品、预处理或染料；显色法要先孵育。直接读吸收的几项也不需要方法开发。
• 样品量上，板式微量紫外（Lunatic 这类）每孔只要 2 µL，一次并行测 96 孔。蛋白纯化、mRNA 体外转录这些场景，样品珍贵，每一微升都不能浪费。

但它不是万能的

它也有局限：

• 灵敏度有限。蛋白定量 A280 的下限在 0.1 mg/mL 左右；再低，就要显色法（BCA 能到 µg/mL）；再低，就得上荧光（Qubit 到 pg/µL）。
• 无法区分同类分子。A280 只给"总蛋白浓度"一个数，分不清抗体 A 和抗体 B。要区分就得上电泳、色谱、质谱。
• 对干扰敏感。样品浑浊、杂质吸光、缓冲液自带吸收，任意一个都能造成偏差。DTT、β-巯基乙醇在 UV 区强吸收，咪唑、EDTA 也有吸收，这些都会让数据失真。
• Beer-Lambert 定律本身有适用范围。浓度一高就偏离线性。高浓度抗体制剂（50 mg/mL 及以上）经常会超出线性范围，需要稀释、短光程或特殊光路设计来绕开。

干扰怎么处理，见本系列的「样品处理」；线性范围的边界，见「Beer-Lambert 定律」。

这个系列会讲什么

10 篇，由浅入深：

# / 内容 / 你能带走什么

0:内容 导论（本篇）;你能带走什么 紫外能测什么、不能测什么的全景

1:内容 光是什么;你能带走什么 为什么是 200–800 nm？上下界各从哪来

2:内容 Beer-Lambert 定律;你能带走什么 公式每个字母的含义、什么时候会失效

3:内容 仪器内部;你能带走什么 Lunatic、比色皿仪器、其他微量仪之间，读数为什么能对齐

4:内容 A280 测蛋白 + 显色法;你能带走什么 ε 是"算"出来的，为什么还需要 BCA / Bradford

5:内容 A260 测核酸;你能带走什么 1.8 / 2.0 这个经验值到底有多不靠谱

6:内容 浑浊样品;你能带走什么 散射校正、导数光谱、什么时候该过滤

7:内容 更多场景;你能带走什么 酶动力学的 NADH 通道；OD600 其实测的是散射

8:内容 样品处理;你能带走什么 比色皿、缓冲液、污染，每次读数波动的原因

9:内容 合规之路;你能带走什么 中国药典对紫外仪查什么，按它放行时厂商交付什么、实验室还要自己复测什么

每一篇都附一手来源：Agilent 技术白皮书、经典论文、中美欧三部药典的紫外章节。

参考来源

Owen T. Fundamentals of Modern UV-Visible Spectroscopy. Agilent Technologies, 2000. · Stoscheck C. M. Quantitation of Protein. Methods Enzymol. 1990, 182, 50–68. · Desjardins P., Conklin D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. 2010, 45, e2565. · Mayerhöfer T. G., Pahlow S., Popp J. The Bouguer-Beer-Lambert Law: Shining Light on the Obscure. ChemPhysChem 2020, 21, 2029–2046.

• panorama · 一张全景：紫外能测什么
• survival · 它为什么至今没被替代
• 200–800 nm · 生物定量常用波段
• 1729 → 1913 · 定律定型的历史跨度