8 种阳离子脂质配上两种磷脂、几档配比，就是 56 种 LNP 配方要逐个做粒径、包封效率和转染效率。可电离脂质 LNP 静脉注射后倾向于在肝脏富集，阳离子脂质是实现肺、脾等器官靶向递送的另一条路，但配方空间大，筛得过来才谈得上选。研究用 Sartorius 的 Sunscreen + LipidBrick 脂质库制备这 56 种 LNP，再用 Stunner AF 做粒径和包封效率表征。转染筛选由 Incucyte 活细胞成像系统完成，覆盖 HEK-293、A498、HuH7、RAW 264.7 和人原代 T 细胞。
Sartorius Polyplus × Unchained Labs 联合应用笔记 · October 2025
Sunscreen + LipidBrick 脂质库制备 LNP，Stunner AF 表征粒径和 EE%，再由 Incucyte 活细胞成像系统做体外转染筛选。
Sunscreen 高通量微流控混合系统用 96 孔板格式自动化完成脂质和 mRNA 溶液的混合、LNP 组装和样品收集。56 种 LNP 在单块 96 孔板上不到 4 小时全部制备完成（逐个制备需要 6 小时以上）。透析去除乙醇后，Stunner AF 在 20 小时内完成所有 56 种配方的粒径、PDI、EE% 和 RNA 浓度表征。其中只有 3 小时需要手动操作，其余 17 小时是自动运行。手动方法做同样的粒径和 EE% 分析要 30 小时以上，而且这些时间里人得一直守在仪器旁。
使用 Sartorius Polyplus 的 LipidBrick 脂质库中 8 种阳离子脂质（IM3c、IM12c、IM13c、IM15c、IM16c、IM21.7c、IM22c、IM25c），加上可电离脂质 SM-102 作为对照。磷脂用 DOPE 或 DSPC 两种，胆固醇和 DMG-PEG 固定。阳离子脂质占比从 20% 到 50%，磷脂 10–50%，胆固醇 28.5–48.5%，DMG-PEG 固定在 1.5%。
eGFP mRNA 溶于 50 mM 柠檬酸钠（pH 4.0）。Sunscreen 以 10 mL/min 流速、3:1（水相：有机相）体积比混合后，用 10 kDa MWCO 透析袋在 PBS 1X（4 °C）中去除乙醇。
Stunner AF 用荧光（RiboGreen）测游离 RNA、UV/Vis + Unmix 测总 RNA、RADLS 测粒径和 PDI，在同一个 2 µL 微孔里同时完成。EE% = (总 mRNA − 游离 mRNA) / 总 mRNA × 100。RADLS 采集静态和动态光散射数据，多角度分析粒径和聚集体。
透析后的 LNP 粒径范围 87–172 nm，未透析的 94–193 nm，都在体内应用的理想粒径范围内（200 nm 以下有利于组织渗透、细胞摄取和低聚集风险）。所有 LNP（透析和未透析）的 EE% 均超过 80%，其中 53 种透析后的 LipidBrick 配方中有 49 种的 EE% 达到或超过 SM-102 对照。
（A）56 种透析后 LNP 的 Z-average 粒径，DOPE（黑色）和 DSPC（黄色）制剂分别标注。（B）EE% 点图，所有配方均超过 80%。数据为 mean ± SEM，n=3，每个点代表一种 LNP 组成。
HEK-293 细胞是 LNP 体外筛选的经典起点。56 种 LNP 处理后在 Incucyte 上监测 48 小时，实时追踪 GFP 荧光（转染效率）、Cell-by-Cell 分类（高/低表达）和 ALFC 无标记活性分析（活/死细胞分类，基于 25 种形态指标）。
24 小时时，21 种配方的 GFP 阳性细胞比例超过 SM-102 对照。38 种配方的 GFP 平均荧光强度达到或超过 SM-102。表现最好的 6 种配方做了详细的动力学分析：IM12c、IM13c 和 IM16c 在 10 小时内就让超过 90% 的细胞转染（对比 SM-102 在 24 小时才到 70%）。其中 3 种是 IM13c 脂质，IM13c-DOPE-Chol-DMG-PEG 摩尔比分别为 20%-40%-38.5%-1.5%、20%-30%-48.5%-1.5% 和 20%-50%-28.5%-1.5%。
HEK-293 细胞 Incucyte 活细胞成像。上排：相差 + GFP 荧光。中排：Cell-by-Cell 分类（高表达=品红，低表达=青色）。下排：ALFC 活性分类（活=绿色轮廓，死=红色轮廓）。NT = 未处理对照。24 小时时间点。
HEK-293 动力学分析。（A）24h 各配方 GFP%。（B）24h GFP 平均强度。（C–D）6 种最佳配方的 GFP% 和强度随时间变化。（E）相对细胞密度。（F）细胞活性。数据为 mean ± SEM。
同一种 LNP 在不同细胞类型上的转染效率可能完全不同。研究者参照文献，用 A498（肾来源的上皮细胞）代表肺靶向、HuH7（肝癌细胞）代表肝靶向，在这两种细胞上做了全面筛选。
A498 细胞（48 小时）：5 种 LipidBrick 配方的 GFP% 与 SM-102 相当，15 种在 GFP 强度上达到或超过 SM-102。表现最好的是 IM13c、IM15c 和 IM16c。
HuH7 细胞（24 小时）：阳离子脂质在肝细胞上的转染效率总体低于 SM-102（符合预期：可电离脂质天然趋肝）。但 IM12c 和 IM21.7c 的部分配方在 GFP 强度上超过了 SM-102，同时不影响细胞活性。综合来看，IM13c、IM15c 和 IM16c 在 A498 上转染效率高、在 HuH7 上效率低于可电离脂质，这种选择性说明它们有潜力用于体内肝外（如肺）递送。
A498（48h）和 HuH7（24h）的转染效率（GFP%）、GFP 强度和无标记细胞活性。每个点代表一种 LNP 组成。数据为 mean ± SEM。
RAW 264.7 巨噬细胞（48 小时）：12 种配方的 GFP% 达到或超过 SM-102，几乎所有配方的 GFP 强度都高于 SM-102。IM16c、IM21.7c 和 IM25c 在 18–24 小时内就让 70% 的细胞转染（SM-102 在 39 小时才到 53%），且不影响活性。
RAW 264.7 巨噬细胞。（A）代表性相差 + 荧光图像及 Cell-by-Cell 分类。（B）4 种 LNP 的 GFP% 动力学。（C）GFP 强度动力学。（D）24h 细胞活性。数据为 mean ± SEM，n=3。
人原代 T 细胞：16 种配方的 GFP% 达到或超过 SM-102，39 种在 GFP 强度上超过 SM-102。IM16c、IM21.7c 和 IM22c 在 12 小时内最多让 52% 的细胞转染。SM-102 在 18 小时达到峰值，也只有 25%。
这些 T 细胞实验只给 SM-102 加了脂蛋白 ApoE4，阳离子脂质 LNP 都没加。SM-102 依赖 ApoE4 与 LDL 受体结合才能进入 T 细胞，而 IM16c、IM21.7c 和 IM25c 不加 ApoE4 也能在 3 小时内转染几乎所有细胞，SM-102 的 GFP 表达要到 6 小时后才出现。它们的 GFP 强度也高于 SM-102，同时不影响细胞增殖。
人原代 T 细胞。（A）5 种 LNP 的 GFP% 和强度动力学。（B）24h 转染效率。（C）24h GFP 强度。（D）相对细胞密度。阳离子脂质 LNP 不需要 ApoE4。数据为 mean ± SEM，n=3。
制备、表征、筛选三步接起来，56 种配方从脂质溶液走到 5 种细胞上的转染曲线。制备用时不到 4 小时，表征的手动操作只有 3 小时，筛选的瓶颈因此落到细胞实验上。
体外结果对阳离子脂质的指向已经比较清楚。它们在 HuH7 肝细胞上效率低于可电离脂质，而在 A498 上转染效率高，这种反差正是肝外靶向要找的选择性，但还要靠体内实验确认。在 RAW 264.7 上，它们的 GFP 强度普遍高于 SM-102。在原代 T 细胞上，它们不加 ApoE4 也能转染，3 小时内就开始表达。所以它们适合做免疫细胞递送的起点配方。