LNP 有多少个、多大、装了多少 RNA？2 µL 一次测出

LNP 有多少个、多大、装了多少 RNA？2 µL 一次测出

颗粒浓度要用 NTA，粒径要用 DLS，RNA 含量要裂解后跑荧光，传统流程因此要在三台仪器上各取一份样品。Stunner 把 RADLS（旋转角度动态光散射）和 UV/Vis 整合在同一个板式平台上，RADLS 读取里还带有多角度光散射（MALS）数据，用来算颗粒浓度。2 µL 原液直测，不用稀释、不用染料、不用标准曲线，2 分钟内同时报告粒径分布、颗粒计数和 RNA 浓度。

Stunner：UV/Vis、RADLS 和 MALS 数据在同一个 2 µL 样品上同步采集。

粒径：RADLS 一次出三种分布

一次 RADLS 读取同时报告三种粒径分布，每种回答的问题不同：

强度分布

质量分布

数量分布

两种 LNP 做对比：小 LNP（SM-102 脂质 + PolyA RNA）和大 LNP（DDAB 阳离子脂质 + 小牛肝脏 RNA）。大 LNP 的 4 次重复质量分布相互重合；换到 5 台仪器上测，质量分布均径为 159 nm（仪器间 CV 4%），小 LNP 为 82 nm（CV 5%）。下图这组数据中，两者的数量分布均径分别为 127 nm 和 47.8 nm。

大 LNP 4 次重复的质量分布叠加图。Stunner 自动优化散射光重叠，重复间相互重合。

小 LNP（左峰，47.8 nm）和大 LNP（右峰，127 nm）的数量分布对比。曲线下面积 = 颗粒浓度。

Z-average vs 数量均径

Z-average 对聚集体高度敏感，有聚集时它会先升高，比质量或数量分布更早报警。但它通常比数量分布的主峰大，因为大颗粒的散射权重高。数量均径更能代表样品中最常见的粒径。

样品 / Z-average (nm) / %CV / 数量均径 (nm) / %CV

未过滤:Z-average (nm) 206;%CV 27%;数量均径 (nm) 136;%CV 5%

0.45 µm 过滤:Z-average (nm) 189;%CV 7%;数量均径 (nm) 129;%CV 4%

0.2 µm 过滤:Z-average (nm) 161;%CV 5%;数量均径 (nm) 124;%CV 4%

大 LNP，5 台仪器 × 4 次重复的汇总值，所以未过滤一行的数量均径与上图的 127 nm 不同。逐步过滤去除大颗粒后，Z-average 和 CV 同步下降。数量均径更稳定。

颗粒计数：MALS 消除角度效应，算出颗粒浓度

LNP 数量越多，散射越强。但散射强度也跟粒径有关：大颗粒散射更强。RADLS 测量中包含多角度光散射（MALS）数据。用这些数据可以同时算出消除角度影响后的粒径和散射强度，从而得到更准的颗粒浓度。

小 LNP（SM-102）平均颗粒浓度 7.5×10¹¹ particles/mL（CV 30%），大 LNP（DDAB）8.5×10¹⁰ particles/mL（CV 28%），相差约 8.8 倍。5 台仪器间的均值都在总平均值的 30% 以内。

（A）大小 LNP 的颗粒浓度。（B）5 台仪器各自的颗粒浓度，仪器间均值在总平均值 30% 以内。误差线 = 4 次重复 SD。

粒径均一性影响计数精度：大 LNP 过 0.2 µm 滤膜去除大颗粒后，计数精密度随之改善。

稀释线性：R² = 0.9983

小 LNP 起始浓度 1.0×10¹² particles/mL，做 5 倍系列稀释，直到 625 倍。最低点实测 1.2×10⁹ particles/mL，线性回归 R² = 0.9983。最低浓度点的 CV 为 32%，说明已接近下限，但尚未到达。81 nm 聚苯乙烯标准珠的测试中观察到 6 个对数级的动态范围（10⁷–10¹³ particles/mL）。

小 LNP 5 倍系列稀释的颗粒浓度，625 倍范围内 R² = 0.9983。5 台仪器 × 4 次重复，误差线 = SD。

RNA 定量：Unmix 扣除浊度，不用裂解

LNP 颗粒的光散射叠加在 RNA 的吸收光谱上，传统 UV/Vis 仪器无法把两者分开。Stunner 的 RNA-LNP 应用用 Unmix 把总吸收光谱拆成 RNA（绿色）、脂质和缓冲液（蓝色）、浊度（灰色）各自的贡献。它直接报告 RNA 总浓度，包括包裹在 LNP 内部的和游离在外面的。测量不需要裂解、不需要染料、不需要标准曲线。

RNA-LNP 应用的 Unmix 光谱拆分。绿色 = RNA 吸收，灰色 = 浊度，黑色 = 扣除浊度后的总吸收，蓝色 = 脂质和缓冲液，黄色 = 残差。

RNA 浓度结果

大 LNP (DDAB)

26.5 ng/µL

CV 2.5%

小 LNP (SM-102)

32.7 ng/µL

CV 1.7%

5 台仪器间差异：大 LNP <1.5%，小 LNP <1.1%

（A）大小 LNP 的 RNA 总浓度。（B）5 台仪器各自的 RNA 浓度。误差线 = 4 次重复 SD。

结合颗粒计数和 RNA 浓度，Stunner 自动计算每个颗粒平均装载的 RNA 分子数。下面就用它比较不同 TFR 下的装载。

工艺优化：TFR 对粒径和装载量的影响

用 Sunscreen 微流控设备在不同总流速（TFR, 6–12 mL/min）下制备 LNP，直接上 Stunner 表征。流速越高，粒径越小、颗粒浓度越高。RNA 浓度不随 TFR 变化（符合预期：FRR 和水相 RNA 浓度恒定时，RNA 总量不变）。Stunner 同时算出每个颗粒的 RNA 分子数，所以能直接看出不同工艺条件对单颗粒装载量的影响。

不同 TFR 下 LNP 的（A）粒径、（B）颗粒浓度、（C）RNA 浓度、（D）每颗粒 RNA 分子数。流速越高，粒径越小、颗粒越多，RNA 总量不变但单颗粒装载量下降。

一次读取，三个维度的答案

TFR 在 6–12 mL/min 范围内升高时，粒径变小、颗粒变多，RNA 总量不变，单颗粒装载量随之下降。这个结论要求粒径、颗粒数和 RNA 量出自同一个样品。Stunner 每个样品用 2 µL、不到 2 分钟就能给齐三者，所有样品在一块板上测完。