LNP 去乙醇回收 98%，AAV 换液空满比基本不变

LNP 去乙醇回收 98%，AAV 换液空满比基本不变

Nunchuck 配出的 LNP 含 12.5% EtOH，要先去掉；AAV 要换缓冲液和浓缩，DNA 要脱盐。这些前处理用透析做太慢，手动超滤又步骤多、回收率不稳定。Unagi 用压力驱动的超滤/透析过滤（UF/DF）自动完成缓冲液置换和浓缩，最多同时处理 8 个样品（0.5–48 mL）。每个循环都用超声测一次保留体积，置换百分比因此是实测算出的：AAV 和 DNA 的目标都是 96%，实测分别为 96.5% 和 96.7%。验证做了 4 个实验：LNP 去乙醇并浓缩 4 倍、AAV 缓冲液置换并浓缩 2 倍、稀释 AAV 浓缩 12 倍、DNA 脱盐并浓缩 3 倍，前后对比都在 Stunner 上测。

Unagi：自动化台式缓冲液置换和浓缩平台，同时处理最多 8 个样品，每个样品 0.5–48 mL。

压力驱动 UF/DF + 超声体积监测

Unagi 的核心耗材叫 Una:单样品一次性容器，再生纤维素膜，截留分子量可选 10、30 或 100 kDa，工作体积 0.5–8 mL。运行过程中 Unagi 在加压过滤、体积测量和补充新缓冲液之间交替进行。压力驱动时板面轻柔混合，防止样品在膜表面堆积。超声体积监测测出每一步的保留体积，置换百分比和浓缩倍数由此算出。

4 种内置应用：Buffer Exchange（置换后可选浓缩）、Concentrate Only（只浓缩）、Buffer Exchange + Concentrate（先置换再浓缩）和 Reduce Sample Volume。Reduce Sample Volume 用板上 Falcon 管把最多 48 mL 的稀释样品减到 8 mL，再进一步浓缩到 0.5 mL，最高 96 倍浓缩。

A. Una 一次性耗材（再生纤维素膜，10/30/100 kDa MWCO）。B. 样品架可装 1–8 个 Una，锁入 Unagi 置换舱。

Unagi UF/DF 流程：输入样品 → 加压过滤 + 混合 → 超声测体积 → 补充新缓冲液 → 重复直到达到目标置换百分比 → 可选浓缩。

Reduce Sample Volume 应用：板上 Falcon 管装最多 48 mL 稀释样品，填入 Una 后加压浓缩到 8 mL，再用 Concentrate Only 进一步缩到 0.5 mL（最高 96 倍）。

LNP：去乙醇 + 浓缩 4 倍，包封效率不变

PolyA-LNP 在 Nunchuck 上配制（SM-102 试剂盒，N:P 8，FRR 3:1，TFR 15 mL/min），配制后含 12.5% EtOH，用含 6.25% EtOH 的 1x PBS 稀释 4 倍，初始浓度为 30.99 µg/mL。4 mL 装入 100 kDa Una，目标置换 98%、浓缩到 120 µg/mL、终体积 1 mL。

Unagi 参数

目标置换:98%

每循环去除:25%（30 psi）

起始浓度:30.99 ± 0.02 µg/mL

起始体积:4 mL

目标浓度:120 µg/mL

目标体积:1 mL

结果（Stunner + RiboGreen）

终浓度:137.68 ± 9.73 µg/mL

终体积:0.88 ± 0.03 mL

粒径:76.76 → 80.78 nm

PDI:0.09 → 0.06

包封效率:99.21 ± 0.37%

回收率:98.41 ± 3.01%

乙醇被去除后，粒径和 PDI 基本不变，包封效率保持 99% 以上，回收率 98%。终体积比 1 mL 的目标略少，终浓度相应高于 120 µg/mL 的目标。整个过程约 2 小时。

AAV：置换 96.5%，空满比基本不变

2.86E13 cp/mL AAV9-CMV-GFP（Virovek）稀释到 5E12 cp/mL，PBS pH 7.0 + 0.001% Pluronic F-68。2 mL 装入 30 kDa Una，目标置换 96%、浓缩到 1E13 cp/mL、终体积 1 mL，每循环去除 33%（15 psi）。前后对比用 Stunner 的 AAV Quant 应用。

AAV 参数 / 置换前 / 置换后

浓度 (cp/mL):置换前 4.93E12 ± 2.9E11;置换后 1.2E13 ± 3.6E11

体积 (mL):置换前 2.2 ± 0.03;置换后 0.98 ± 0.03

% exchanged:置换前 —;置换后 96.5 ± 0.1%

空/满比:置换前 21/79;置换后 18/82

空壳比例从 21% 略降到 18%，UL 推测与置换时去除了部分游离 DNA 有关。

稀释 AAV：12 mL 浓缩到 1 mL（12 倍）

5E11 cp/mL AAV9 在 PBS + 0.001% Pluronic F-68 中，12 mL 装入 30 kDa Una。分两步浓缩：先用 Reduce Sample Volume 从 12 mL 缩到 8 mL，再用 Concentrate Only 从 8 mL 缩到 1 mL，合计 12 倍。

AAV 参数 / 浓缩前 / 浓缩后

浓度 (cp/mL):浓缩前 5.00E11;浓缩后 5.9E12 ± 1.6E11

体积 (mL):浓缩前 8.1 ± 0.03;浓缩后 1.02 ± 0.02

空/满比:浓缩前 10/90;浓缩后 15/85

目标浓度 6.0E12 cp/mL，实测 5.9E12。空/满比从 10/90 变为 15/85，空壳比例有所上升。「浓缩前」体积是 Reduce Sample Volume 之后的实测值。

DNA 脱盐：Tris-EDTA 换成无核酸酶水，浓缩 3 倍

Salmon sperm DNA 2 mg/mL 在 Tris-EDTA pH 8.0 中，3 mL 装入 30 kDa Una。用 Nucleic Acid 预设参数，目标置换 96%、每循环去除 50%（60 psi）、浓缩到 6 mg/mL、终体积 1 mL。前后定量用 Stunner 的 UV/Vis 测量。

DNA 参数 / 脱盐前 / 脱盐后

浓度 (mg/mL):脱盐前 2.1 ± 0.006;脱盐后 6.7 ± 0.2

体积 (mL):脱盐前 3.3 ± 0.03;脱盐后 1 ± 0.02

% exchanged:脱盐前 —;脱盐后 96.7 ± 0.2%

不同分子选不同压力和每循环去除比例

这几个实验用的参数各不相同：AAV 用 15 psi、每循环去除 33%；LNP 用 30 psi、每循环去除 25%；核酸用 60 psi、每循环去除 50%。Unagi 按分子类型提供预设参数（如 DNA 实验用的 Nucleic Acid 预设），用户也可以自定义压力和去除速率。

在这 4 个实验的条件下，LNP 换液和浓缩后粒径、PDI 和包封效率基本不变。AAV 空壳比例在置换实验中略降，在稀释浓缩实验中有所上升。LNP 这一步约 2 小时，可以直接接在 Nunchuck 配制和 Stunner 表征之间，代替耗时的透析。

A. Nunchuck：微流控配制 LNP。B. Stunner：UV/Vis + DLS 表征。Unagi 在两者之间完成样品前处理。