传统流程先逐个跑 DLS，再做全套 RiboGreen EE% 测定：两套标准曲线、两组稀释样品、表面活性剂裂解、孵育、防气泡。粒径加 EE%，12 个样品做一遍要 266 次移液、不到 70 分钟手动操作，总时间 ~120 min。Stunner 的 Unmix 可以从光谱中扣除 LNP 的浊度贡献，直接测总 RNA，不需要表面活性剂。只保留 RiboGreen 测游离 RNA 的部分，移液降到 114 次，手动操作不到 20 分钟，总时间 35 分钟。这个混合方法在 PolyA 筛选和 FLuc mRNA 生产两组实验中都做了验证。
RiboGreen 或 SYBR Gold 与 RNA 结合后荧光增强，以此定量。测 EE% 需要两步：游离 RNA 用染料 + 空白缓冲液稀释后测；总 RNA 要先加表面活性剂（通常是 Triton X-100）裂解 LNP 释放 RNA，再加染料测。两步各自需要独立的标准曲线和空白，因为 Triton X-100 本身有荧光背景。
样品不能有气泡（否则要拿针头逐个戳掉），表面活性剂加完要孵育，染料加完还要再孵育。一块 96 孔板做 12 个样品（每个样品双孔重复），266 次移液，花费 $50+ 的染料，一个熟练操作员做完这块板也要接近 1 小时。要加样品，整套标准曲线和空白都得重新做。
Stunner 的 RNA-LNP 应用用 Unmix 算法从 LNP 总光谱中拆出 RNA 的吸收贡献，不需要表面活性剂裂解颗粒。同时 RADLS（旋转角度动态光散射）测粒径、PDI 和颗粒浓度。2 µL 原液直测，5 分钟加完 12 个样品。
这样就省去了传统流程中测总 RNA 的那一半：不用配表面活性剂、不用担心气泡、不用做总 RNA 的标准曲线和空白。只保留 RiboGreen 测游离 RNA 的部分（加染料到稀释样品，一套标准曲线）。Stunner 跑总 RNA 的同时可以准备 RiboGreen 板，两边同时进行。
EE% 公式不变：EE% = (总 RNA − 游离 RNA) / 总 RNA × 100。
Stunner RNA-LNP 应用的 Unmix 拆分：RNA（绿色）、浊度（灰色）、脂质/缓冲液（蓝色）。黑色 = 扣除浊度后的总光谱。不需要裂解。
混合方法（Stunner + 简化 RiboGreen）
Stunner（粒径 + 总 RNA）35 min 总 / 5 min 手动简化 RiboGreen（游离 RNA）15 min 总 / 12 min 手动
> 合计35 min / <20 min 手动
传统方法（逐个 DLS + 全套染料法）
逐个 DLS60+ min / 30–60 min 手动全套染料法 EE%45–60 min / 40 min 手动合计~120 min / <70 min 手动
12 个样品，含粒径、总 RNA、EE%。混合方法中 Stunner 和 RiboGreen 可同时进行。
3 种 LNP 配方（LNP-X、LNP-Y、LNP-Z）在 Sunscreen 上制备，各做两次重复。分别用 20 mM 柠檬酸和 20 mM 乙酸（pH 4.0）两种反应缓冲液，PolyA 作为低成本 RNA 替代物。透析到 PBS 1X 后上 Stunner。
乙酸缓冲液在三种配方中都产生更小的颗粒（LNP-X 差异较小）。LNP-Z 在乙酸缓冲液中 Z-average 不到柠檬酸的一半，PDI 也更低。所有样品 PDI 均小于 0.2，粒径均在 100 nm 以下（LNP-Y 和 LNP-Z 在柠檬酸中除外）。透析后颗粒浓度约 9×10¹¹ particles/mL。LNP-Z 柠檬酸组的颗粒大，同样的物料组装出的颗粒更少，所以浓度明显低于其他组。
三种 LNP 在两种缓冲液中的 Z-average 和 PDI。两次重复。
颗粒浓度。LNP-Z 柠檬酸组因粒径大，浓度大幅偏低。两次重复。
PolyA 样品使用了基于 PolyA 序列的自定义 RNA 分析物（analyte）来优化 Unmix 拆分。两种方法测得的 EE% 通常相差不到 1%。LNP-Z 在两种缓冲液中的总 RNA 浓度都高于另两种配方。它在柠檬酸缓冲液中 EE% 最低，两种方法测得的都在 90% 以下，其余各组都在 90% 以上。
Stunner（绿色）和 RiboGreen（灰色）测得的总 PolyA 浓度。两次重复。
混合法和标准 RiboGreen 法测得的 EE%。两次重复。
PolyA 筛选确定了最佳缓冲液（20 mM 乙酸）后，三种配方改用 FLuc（萤火虫荧光素酶）mRNA 做正式生产。Stunner 的 RNA 分析物设为 2 kb。
三种 LNP 的 PDI 均 ≤ 0.2，粒径分布窄。Stunner 三次测量重复的总 RNA CV 小于 1%，RiboGreen 双孔重复的 CV 在 0.2–5.2% 之间，所以 Stunner 这一侧的重复性更好。
FLuc mRNA LNP 的粒径和 PDI。三次重复，误差线 = SD。
Stunner（绿色）和 RiboGreen（灰色）测得的总 RNA 浓度。Stunner CV < 1%（三次重复），RiboGreen CV 0.2–5.2%（两次重复）。
所有配方的 EE% 均超过 90%，LNP-Z 最低为 91%（混合方法测得）。
混合法和标准法测得的 EE%。所有配方 > 90%，LNP-Z 最低 91%。
Stunner 还能追踪工艺全程的 RNA 浓度变化：从投料水相 → 初始 LNP（未透析）→ 透析后 LNP。这部分只追踪了 LNP-Y 和 LNP-Z 两种配方。两者在混合步骤中浓度都下降约 25%，原因是水相与有机相按 3:1 混合后体积增大、样品被稀释，RNA 本身并没有损失。透析后，LNP-Z 保留了 98% 的 RNA（最终包封收率 85%），而 LNP-Y 又损失了 22%（最终包封收率 71%）。LNP-Y 在透析过程中有泄漏，配方或工艺有改进空间。
投料水相、初始 LNP 和透析后 LNP 的总 RNA 浓度。LNP-Z 透析保留 98%（最终包封收率 85%），LNP-Y 透析损失 22%（最终包封收率 71%）。
LNP 制备（Sunscreen）
透析：20K MWCO G3 Dialysis Cassettes (Thermo Fisher)，PBS 1X，3 小时。
总 RNA（Stunner）：软件选择 nanoparticles 测量类型 → RNA-LNP 应用。非标准 RNA 构建体建议创建自定义 RNA 分析物（详见 Stunner 软件用户指南）。每个样品 2 µL，三次重复。
游离 RNA（简化 RiboGreen）：取 10 µL 样品稀释到 240 µL TE 缓冲液中（96 孔板 Row A，13+ 样品时扩展到 Row D）。不需要表面活性剂、不需要总 RNA 的标准曲线和空白。
Stunner Plate 布局示例。绿色 = 样品位（三次重复）。
简化 RiboGreen 布局：Row A = 稀释样品。
RiboGreen 标准曲线布局。
Stunner 用 Unmix 扣除浊度后测总 RNA，取代了传统流程中的表面活性剂裂解和总 RNA 标准曲线。12 个样品加到 Stunner Plate 上只要 5 分钟（传统 DLS 逐个上样要 30–60 分钟）。简化后的 RiboGreen 只做游离 RNA，移液从 266 次降到 114 次，板准备从 45 分钟以上降到 15 分钟以内。
两组实验中，混合法和标准 RiboGreen 法得出的 EE% 结论相同：PolyA 筛选里 LNP-Z 柠檬酸组都最低，FLuc mRNA 的三种配方都超过 90%（混合方法测得）。Stunner 还能追踪从投料到透析后的 RNA 收率变化，可以用来定位哪个工艺步骤在损失 RNA 载荷。