UV/Vis 给出样品有多少（浓度），DLS 给出样品有多大、有没有聚集；Stunner 的 DLS 覆盖 0.3–1000 nm。从一束激光到粒径数据，中间要经过散射光强度的波动、自相关函数和扩散系数，最后才是粒径。
DLS（Dynamic Light Scattering，动态光散射）测量溶液中分子或颗粒的流体动力学直径（hydrodynamic diameter, Dh）。Dh 是分子在溶液里实际表现出的大小，包含了水化层。不同类型的样品，Dh 差异很大：蛋白单体 5–15 nm，AAV 衣壳 20–30 nm，LNP 50–200 nm，聚集体可以到几百甚至上千 nm。
粒径之外，DLS 还给出多分散指数（polydispersity index, PdI），衡量样品粒径分布有多宽。PdI 越小，分布越窄，样品越均一。
### PdI 判读参考
- ≤ 0.1：单分散，一个窄峰。Z-average 和 PdI 就足够描述样品
- 0.1–0.2：中等多分散，有少量聚集体或其他组分；粒径分布算法在这个范围工作效果最好
- > 0.2：高度多分散，显著聚集或多种大小的颗粒混在一起
这些是指导值，不作硬性分界。实际判读要结合样品类型和实验目的。
### 1. 布朗运动产生散射光波动
溶液中的分子不停做无规则运动（布朗运动），激光照上去后散射光的强度随时间快速变化。小分子运动快，散射光强度波动也快；大分子运动慢，波动也慢。
### 2. 自相关函数捕捉波动速率
把不同时刻的散射光强度做自相关运算，得到一条从高点衰减到基线的曲线，也就是自相关曲线（correlogram）。衰减越快，分子运动越快，粒径越小。
### 3. 从扩散系数算粒径
拟合自相关曲线得到平移扩散系数 Dt，再用 Stokes-Einstein 方程反推流体动力学直径：Dh = kBT / (3πηDt)。温度 T 和溶剂粘度 η 已知的情况下，扩散系数完全由粒径决定。
### 4. 累积量拟合：Z-average 和 PdI
对自相关曲线做二阶累积量拟合，第一项给出 Z-average 粒径，第二项给出 PdI。样品包含多种大小的颗粒时，Stunner 的专有算法进一步反解自相关函数，计算完整的粒径分布。
理想自相关曲线（correlogram）。最高点接近 1.0，衰减到基线后趋于稳定。衰减越快说明粒径越小。
X 轴是延迟时间（delay），Y 轴是归一化的自相关系数。一条理想的 correlogram 从接近 1.0 的高点出发，呈 S 形衰减到基线。
粒径怎么影响曲线形状？小分子运动快，相邻时刻的散射光强度很快就失去相关性，自相关衰减快，曲线整体左移。大分子运动慢，自相关维持时间更长，曲线右移。
单分散样品产生一条光滑的 S 形曲线。多分散样品的曲线会变形(拉伸、出现台阶)，因为不同大小的颗粒各自贡献了不同衰减速率的分量。算法要从这条变形的曲线中反解出粒径分布，样品越复杂，反解难度越大。
### A 值：数据质量指标
Stunner 用 A 值（amplitude at τ→0，即截距）衡量信号与噪声的比值。A 值越高，自相关曲线的起点越接近理论值，数据质量越好。A 值太低通常意味着样品浓度不够或散射信号太弱。
传统 DLS 在一个固定角度测量。Stunner 的 RADLS（Rotating Angle DLS）在 7 个不同角度上各采集一组数据，综合后还原粒径分布。
多角度的优势在于：光散射的强度和角度有关（Mie scattering），不同大小的颗粒在不同角度上散射强度分布不同。单角度只看到一个"截面"，可能高估或低估某一类颗粒的占比。7 个角度的数据放在一起，算法能分开不同大小颗粒各自的贡献。多分散样品（比如同时含有单体和聚集体的蛋白溶液）获益最明显。
代价是时间：单角度 DLS 96 个样品约 1 小时，RADLS（7 角度）约 2 小时。
### 怎么选
快速筛选只需要 Z-average 和 PdI，单角度够用。复杂样品、需要可靠的粒径分布、或者结果要放到报告里，用 RADLS。
Stunner 的 Details 界面同时显示三种粒径分布图：强度加权、质量加权和数量加权。同一个样品在三张图上看起来可能完全不同。差别来自观察角度，数据本身并不矛盾。
同一个样品的强度分布（左，绿）和质量分布（右，蓝）。强度分布中 25.4% 的聚集体峰（Pk2, 83.1 nm）在质量分布中只占 0.2%。质量分布里这个峰位于 65.1 nm。
### 强度加权分布（Intensity Distribution）
DLS 直接测到的原始信号。散射强度和分子量的平方成正比（∝ MW²），所以哪怕只有极少量的聚集体，在强度分布上也会形成一个显眼的峰。上图左侧：Pk1 = 9.1 nm 占 74.6%，Pk2 = 83.1 nm 占 25.4%，看起来聚集体不少。适合质控场景，微量聚集也藏不住。
### 质量加权分布（Mass Distribution）
从强度分布除以分子量（每个 size interval 除以对应的 MW 估算值）换算得到。上图右侧：同一个聚集体峰按质量只有 0.2%（Pk1 = 8.9 nm / 99.8%, Pk2 = 65.1 nm / 0.2%）。MW 来自下文的 Rh–MW 估算，所以这是近似的质量占比。
### 数量加权分布（Numbers Distribution）
从强度分布除以 MW² 再乘 Avogadro 常数换算得到，反映各种大小的颗粒有多少个。对大颗粒的压制最强，聚集体峰几乎消失，因为按颗粒数算它确实极少。
检测聚集看强度分布，微量聚集体在这里最明显。了解各组分实际占比看质量分布。判断"大部分颗粒有多大"看数量分布。
粒径分布告诉你样品"有多大"，但有时候还想知道"有多重"，也就是分子量。Stunner 除了 DLS（动态光散射）还内置了 SLS（Static Light Scattering，静态光散射）。SLS 通过总散射光强度和浓度直接测分子量。DLS 测的是尺寸，不直接给分子量。不过球形分子的流体动力学半径（Rh，即 Dh 的一半）和分子量之间有经验关系，Stunner 用这个关系做估算。
流体动力学半径（Rh）与分子量（MW）的对数关系。回归方程 Est. MW = 2.75 × Rh²·⁴⁹ 基于球形蛋白假设。
上图是用一组标准蛋白建立的回归关系：Insulin（5.8 kDa）、Lysozyme（14.5 kDa）、BSA（66.8 kDa）、Hexokinase（104 kDa）等。在对数坐标下，Rh 和 MW 呈线性关系。拟合方程 Est. MW = 2.75 × Rh2.49 可以从 DLS 测到的 Rh 反推分子量。
这是估算，假设前提是球形。非球形分子（如纤维状蛋白）会偏离回归线。另外，少量聚集体（二聚体、三聚体）的存在会显著拉高表观 Rh，导致 MW 估算值偏大。需要准确分子量的场景，应该用 SLS 数据。
除了一个样品测一次，DLS 还有一个进阶用法：配一组浓度梯度，观察粒径和散射强度随浓度的变化趋势。由此可以推断蛋白分子之间是互相排斥还是互相吸引。这决定了蛋白在高浓度下会不会聚集，影响制剂稳定性和货架期。B₂₂（第二维里系数）和 kD（扩散相互作用参数）就是量化这种分子间相互作用的指标。
测量方法：配一组浓度梯度的同一个蛋白（建议 4–5 个浓度，跨 3–5 倍范围），每个浓度都做 DLS。扩散系数对浓度作图，拟合直线的斜率除以截距（无限稀释时的扩散系数）就是 kD。B₂₂ 则来自散射强度对浓度的拟合。
在高浓度单抗制剂的开发阶段，kD 筛选可以在很早期排除掉不稳定的候选物。每个候选分子只要 4–5 个浓度点，96 个孔位可以并排比较多个分子。
### 下一步
→ 从打开软件到出数据
→ DLS 结果怎么看