同为胺基偶联，FITC 让这支单抗的 Tagg 略降，AF350 NHS 酯却让它升高；马来酰亚胺偶联则让 Tagg 降了 3.6 °C。这类差异要在早期就测出来，传统方法（SEC、质谱）却耗时长、样品多，每换一个候选分子就要重新优化。实验用三种 payload/linker 组合（FITC、AF350 NHS 酯、AF350 C₅ 马来酰亚胺）偶联同一支单抗。先在 Stunner 上用 2 µL 同时筛 DAR、浓度、粒径和 PDI，建立筛选标准后选出 3 个候选物。再在 Uncle 上用 9 µL 做制剂辅料筛选（trehalose、arginine、Tween 80）和热应力测试（Tm 和 Tagg）。
实验条件
偶联反应：FITC（Thermo Fisher 46425）、AF350 NHS 酯（A10168）、AF350 C₅ 马来酰亚胺（A30505）分别与 10 mg/mL 单抗反应。缓冲液为 50 mM 硼酸盐 pH 8.5、100 mM 碳酸氢盐 pH 8.3、1× PBS。马来酰亚胺反应加 100 µg TCEP 还原二硫键。室温避光孵育 1 h。
纯化：Unagi 缓冲液交换至 PBS，去除游离 payload。
Stunner 设置：2 µL/孔 × 四次重复，DLS 5 次采集 × 1 秒，自动离群值剔除。
Uncle 设置：Tm & Tagg 应用，9 µL/比色皿 × 三次重复，15–95 °C，0.3 °C/min，激发 266 + 473 nm。Tm 取 300–380 nm BCM，Tagg 取 266 nm SLS。
制剂辅料：Tween 80（0.01%）、trehalose（80 mg/mL）、arginine（10 mg/mL），蛋白浓度 2 mg/mL。
A. Stunner：UV/Vis + DLS，2 µL 同时测 DAR、浓度、粒径。
B. Uncle：荧光 + SLS + DLS，9 µL 评估热稳定性。
Stunner 的 Unmix 算法把 ADC 的 UV/Vis 吸收光谱拆分成抗体和 payload 两个组分，分别定量后算出 DAR。用 AF350 NHS 酯做了 4 个摩尔比（2:1、10:1、20:1、40:1）的偶联反应。低摩尔比时 DAR 近似等于投料比（2:1 → DAR 2.1，10:1 → 9.6），但高摩尔比时偏离加剧（20:1 → 15，40:1 → 30.3）。原因在于 NHS 酯优先与赖氨酸残基反应，可用位点有限，DAR 会趋向平台。
回收率方面，2:1 到 20:1 都超过 80%（82%、94%、81%），但 40:1 只有 70%。Stunner 同时给出的浊度校正值（A330）解释了原因：低摩尔比浊度接近零，40:1 明显升高。这说明形成了大颗粒聚集体，部分 ADC 在纯化过程中因沉淀而损失。
AF350 NHS 酯在 2:1、10:1、20:1、40:1 摩尔比下的 DAR（绿色柱，左轴）和浊度 A330（灰色点，右轴）。% recovery 标注于底部。误差棒 ± 1 SD，四次重复。
偶联改变了单抗的流体动力学直径。DAR 2.1 的 ADC 直径和未偶联单抗几乎相同，但 DAR 越高直径越大，趋势与 DAR 一致。PDI 方面，经验法则是：蛋白和 ADC 的 PDI 不超过 0.1 算单分散，超过 0.2 就有聚集风险。AF350 NHS 酯系列的 PDI 都小于 0.1，只有 DAR 30.3 的样品为 0.11。结合它的高浊度和低回收率，这个载药量在该单抗上没有产生稳定的 ADC。
DAR 15 的样品在反应当天看起来也不错：12 nm 处单一尖峰。存放 4 °C 一周后，DLS 强度分布上出现了大粒径聚集峰。质量分布显示聚集体目前只占 ~1%，但趋势值得警惕。DAR 30.3 的样品聚集更严重（数据未展示）。
AF350 NHS 酯标记单抗的流体动力学直径（蓝色柱，左轴）和 PDI（灰色点，右轴）。DAR 从左至右递增。
DAR 15 的 AF350 NHS 酯 ADC：反应当天（上）和 4 °C 存放 7 天后（下）的 DLS 强度分布（绿色，左）和质量分布（蓝色，右）。一周后出现大粒径聚集峰。
Stunner 在同一个 2 µL 孔里同时报告 DAR、浊度、粒径和 PDI。综合初步筛选数据，设定了 4 条候选物入选标准：
按此标准从 3 种 payload/linker 组合中各选出了最优摩尔比的 ADC，送 Uncle 做热稳定性测试：
Payload / Linker / 摩尔比 / DAR / 直径 (nm) / PDI / 回收率
FITC:摩尔比 10:1;DAR 3.7;直径 (nm) 13.2;PDI 0.1;回收率 86%
AF350 NHS 酯:摩尔比 2:1;DAR 2.1;直径 (nm) 11.1;PDI 0.03;回收率 82%
AF350 C₅ 马来酰亚胺:摩尔比 10:1;DAR 2.1;直径 (nm) 11.4;PDI 0.1;回收率 93%
Table 1. 符合标准的 3 个 ADC 候选物，用于 Uncle 热稳定性测试。
ADC 中的 payload 在 UV 激发下也会发荧光，和蛋白内源荧光重叠。Uncle 的全光谱荧光检测能直接看到两者的发射峰（蛋白 ~330 nm，AF350 ~440 nm），通过把 BCM 分析范围限定在 300–380 nm 来排除 payload 干扰。
AF350 标记单抗在 Uncle 中 15–95 °C 热升温过程的发射光谱（266 + 473 nm 激发）。蛋白内源荧光（~330 nm）和染料荧光（~440 nm）清晰可分。
先用亲本单抗做辅料筛选基线：trehalose 对 Tm 和 Tagg 的提升最大，arginine 作为离液剂（chaotrope）降低了 Tm 但略微提高了 Tagg，Tween 80 对两者几乎没有影响。所有条件下 Tm 都明显低于 Tagg，也就是说蛋白先解折叠，再升温一段才开始聚集。
2 mg/mL 单抗在 PBS（绿）、+Tween 80（蓝）、+trehalose（黄）、+arginine（紫）中的熔化曲线（实线，左轴 BCM）和聚集曲线（虚线，右轴 SLS）。竖线标记 Tm（实）和 Tagg（虚）。三次重复。
偶联会改变单抗表面性质。FITC 和 AF350 NHS 酯都靶向赖氨酸（亲水残基变疏水），马来酰亚胺靶向 TCEP 还原后的半胱氨酸（破坏二硫键）。三种偶联对 Tagg 的影响方向和幅度都不同：
但制剂优化可以补偿偶联带来的稳定性损失。trehalose 对所有 ADC 都有效，马来酰亚胺偶联物的改善最大：Tagg 从 PBS 中的 71.6 °C 提高到 76.2 °C，改善近 5 °C。arginine 通常降 Tm 升 Tagg，但加到马来酰亚胺 ADC 里时两个参数都改善了。辅料的效果因 ADC 结构而异，不能照搬单抗的经验。
A. PBS 中：单抗（绿）及 FITC（蓝）、AF350 NHS（黄）、AF350 马来酰亚胺（紫）。B. PBS + trehalose 中同样 4 个样品。实线 = 熔化（BCM），虚线 = 聚集（SLS）。竖线标记 Tm/Tagg。三次重复。
样品 / PBS / +trehalose / +arginine / +Tween 80
Tm:PBS Tagg;+trehalose Tm;+arginine Tagg;+Tween 80 Tm;Tagg;Tm;Tagg
mAb:PBS 69.8±0.1;+trehalose 75.2±0.3;+arginine 71.0±0.1;+Tween 80 76.9±0.2;69.5±0.1;75.8±0.3;69.7±0.0;74.9±0.1
+FITC (3.7):PBS 69.5±0.1;+trehalose 74.4±0.3;+arginine 70.4±0.1;+Tween 80 76.4±0.1;69.3±0.2;75.0±0.2;69.4±0.3;74.2±0.4
+AF350 NHS (2.1):PBS 70.5±0.1;+trehalose 75.8±0.2;+arginine 71.7±0.7;+Tween 80 78.0±0.9;69.6±0.1;75.5±0.2;70.6±0.2;75.8±0.2
+AF350 mal (2.1):PBS 69.5±0.1;+trehalose 71.6±0.2;+arginine 71.5±0.2;+Tween 80 76.2±0.4;70.1±0.2;74.4±0.2;70.0±0.2;71.5±0.9
Table 2. 全部 Tm/Tagg 数据（°C），三次重复均值 ± 1 SD。马来酰亚胺 ADC 的 Tagg 在 PBS 中最低（71.6），加 trehalose 后改善至 76.2（+4.6 °C，高亮）。
Stunner 在偶联反应后第一时间给出 DAR、浓度、粒径和 PDI，据此尽早淘汰载药过高、聚集严重或回收率不达标的条件，省下后续每一步的样品和时间。Uncle 接力做热稳定性评估，Tm 和 Tagg 的 SD 小于 1 °C，可以可靠地区分不同偶联化学和制剂辅料的效果。
偶联化学对稳定性的影响很难预判：同为胺基偶联的 FITC 和 AF350 NHS 酯，对稳定性的影响方向相反；马来酰亚胺偶联通过破坏二硫键引起的 Tagg 下降幅度最大（−3.6 °C），但 trehalose 也给了它最大的补偿（+4.6 °C）。连接子、payload 和偶联位点的选择对稳定性的影响无法从相关化合物外推，必须实测。Stunner 每样品 2 µL、Uncle 每样品 9 µL，因此在早期发现阶段就能系统地实测这些变量。