有无消光系数和参考光谱，Stunner 都能测 DAR

药物消光系数还没定，或药物光谱与抗体高度重叠时，双波长法就算不出 DAR。Stunner 用光谱解混算法解决了这个问题：即使没有任何药物光谱先验信息，也能分析。UV/Vis 法本身快、操作简单，适合跨实验室标准化，也适合在发现和工艺开发阶段大量筛选样品。在三种曲妥珠单抗 ADC 上，Decode 不用任何药物信息，4 次重复的 DAR CV 不超过 0.5%。

3 种方法 — 按已知条件选择
DAR CV ≤0.5% — Decode 4 次重复
0.98–1.04 — DAR 归一化比值
DLS 同步 — 粒径 + 聚集筛查

实验样品

Trastuzumab（HY-P9907）、T-Emtansine（HY-P9921）、T-Deruxtecan（HY-138298A）、T-Vedotin（HY-164992）、Naratuximab（HY-P99374）、N-Emtansine（HY-132260）、Gemtuzumab（HY-P9997）、G-Ozogamicin（HY-109539），均购自 MedChemExpress；本文展示的是曲妥珠单抗及其三种 ADC 的数据。Stunner（P/N: 900-2003）+ Stunner plates（P/N: 701-2125），软件 v10.1。

Stunner 微流控板：2 µL 样品同时采集 UV/Vis 浓度和 DLS 粒径数据。

已知消光系数 → ADC Dual Wvl

抗体和药物在两个波长的摩尔消光系数都已知时，Dual Wvl 最直接。Stunner 自动完成双波长联立方程计算，手动输入 ε 或调用存储的 Analyte 都行。

三种曲妥珠单抗 ADC 各做 1:2 稀释系列（8 倍浓度范围，起始 4.8、5.0、2.9 mg/mL）。药物/抗体浓度比值全程稳定在 1.89–2.17。各稀释点的 DAR 归一化比值在 0.98–1.04 之间，说明 DAR 不随稀释变化。

1:2 稀释系列：抗体和药物浓度按 2 倍递减，DAR 始终恒定。三种曲妥珠单抗 ADC，Dual Wvl 应用测得。

有参考光谱 → ADC Quant 全光谱拟合

ADC Quant（含 DLS 时为 ADC + Sizing）调用 Stunner 数据库中存储的抗体和药物完整参考光谱，用全波段最小二乘拟合拆分 ADC 总光谱。相比 Dual Wvl 只看两个波长点，利用完整的药物和抗体光谱来评估浓度，信噪比和抗干扰能力都更强。能建参考光谱时优先考虑这个方法；本文没有单独给出它的验证数据。

参考光谱可以来自之前的实验：把抗体和药物的纯品光谱存储到 Stunner 数据库后，后续所有批次直接调用，不需要每次重新准备标准品。

什么都没有 → ADC Decode 从光谱里拆

早期候选分子的药物消光系数往往没有确定，或者偶联后光谱位移导致文献值不适用。药物和抗体的光谱重叠太严重，也会让双波长法失效。ADC Decode 不需要任何药物先验信息。

ADC 上机后，蛋白浓度有一个可能的范围：上限是 ADC 总吸光度全部归属蛋白时的浓度，下限是零。Decode 在这个范围内搜索：它从 Stunner Analyte 库调用蛋白光谱模型，利用色氨酸在 280–300 nm 区域的吸收特征找到最佳蛋白拟合。ADC 总光谱减去最优蛋白贡献，剩下的就是药物光谱。

从 ADC 总光谱（虚线）中搜索最佳蛋白拟合。每条实线对应一种可能的蛋白浓度和互补的药物光谱，算法利用色氨酸吸收特征找最优解。

Decode 精密度（4 次重复）

- T-Emtansine — 0.6% — 0.5%

- T-Deruxtecan — 0.5% — 0.2%

- T-Vedotin — 0.6% — 0.5%

ADC Decode 对 T-Emtansine（A）、T-Deruxtecan（B）和 T-Vedotin（C）的解卷积。左侧为总光谱拆分，右侧为各次重复的药物光谱叠加，重复间相互重合。

没有消光系数时，可以用药物光谱与蛋白光谱的吸光度比值（如 T-Emtansine 的 A252nm/A280nm = 0.48）在工艺步骤或批次间做相对比较。有了 ε 就直接输出绝对 DAR。

Decode 和 Dual Wvl 并排跑：浓度随稀释的趋势一致

同一组 1:2 稀释系列，两种方法同时分析。未偶联曲妥珠单抗浓度 CV 0.2%，三种 ADC 浓度 CV 0.3–0.4%。DAR 精密度：高浓度端 CV 0.5–1.4%，低浓度端 CV 0.8–4.3%。两种方法测得的浓度都随稀释线性下降，趋势一致。

三种 ADC 稀释系列，Dual Wvl（绿）和 Decode（蓝）并排。上图药物浓度，下图抗体浓度（Y 轴对数坐标）。两种方法趋势一致。

DLS 同步检测粒径和聚集

聚集是 ADC 开发中的常见问题，Stunner 的每个 UV/Vis ADC 应用都可以配合 DLS 同步检测粒径和聚集体。ADC Decode + Sizing 应用在测 DAR 的同一次读取中跑 DLS。

三种 ADC 的流体动力学直径：T-Emtansine 11.8 ± 0.4 nm，T-Deruxtecan 14.3 ± 0.5 nm，T-Vedotin 10.2 ± 0.8 nm，± 值来自三次重复。T-Deruxtecan 粒径略大于其他两种，可能存在轻微聚集，值得进一步排查。

T-Emtansine 11.8 ± 0.4 nm

T-Deruxtecan 14.3 ± 0.5 nm

T-Vedotin 10.2 ± 0.8 nm

手头有什么条件，就用什么方法

有消光系数用 Dual Wvl 快速解算，有参考光谱用 ADC Quant 全光谱拟合（本文未给它的验证数据），什么都没有用 ADC Decode 直接从光谱里拆出药物贡献。三种方法都只用 2 µL 样品，加上 DLS 还能在同一次读取里看粒径和聚集，缺消光系数时也能出 DAR。

References

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Nakatsuji M, et al. Human Lipocalin-Type Prostaglandin D Synthase-Based Drug Delivery System. PLOS ONE 2015, 10(11):e0142206.

DAR CV ≤0.5% · Decode 4 次重复
0.98–1.04 · DAR 归一化比值