传统紫外法测 DAR 要凑齐四个消光系数，一个都不能少；样品稍有散射或浊度，联立方程解出来就偏。HIC 和质谱绕开了这些限制，但一个样品要几十分钟到一小时，样品消耗大，通量上不去。
Stunner 改看整条曲线：用 Unmix（光谱解卷积） 分析全波段光谱，把抗体、payload 和浊度分开算，不再依赖两个读数点。2 µL 样品、十分钟左右出 96 个结果。payload 的 ε 未知时，绝对 DAR 的标尺由一次 HIC 或 MS 的参考值给出。
选哪种方法取决于手头的已知条件：四个消光系数齐全可用 ADC Dual Wvl，建好 payload 参考光谱用 ADC Quant，什么都没有用 ADC Decode。
Stunner 软件中 Protein 类别下的三种 ADC 分析应用：ADC Quant（全谱定量）、ADC Dual Wvl（双波长法）、ADC Decode（光谱解码）。右侧 Concentration + Sizing 列可同步搭配 DLS 测粒径。
紫外法测 DAR 靠的是抗体和 payload 吸收峰位不同。抗体吸收峰在 280 nm，多数 payload 在其他波长有独特吸收（MMAE ~248 nm，DM1 ~252 nm，拓扑异构酶 I 抑制剂 ~360 nm），拆开各自浓度就能算出 DAR。
难点在于把信号拆开。ADC 上机后得到的是一条混合曲线：抗体、payload、缓冲液背景、浊度散射全叠在一起。传统紫外法只取两个波长点的读数，联立两个 Beer-Lambert 方程求解。
DM1 (a)、曲妥珠单抗 (b) 和 T-DM1 偶联物 (c) 的紫外吸收光谱。红色虚线标记了双波长法所需的两个读数点：252 nm（DM1 最大吸收）和 280 nm（抗体最大吸收）。来源：Chen Y, Methods in Molecular Biology, 2013, Chapter 16.
这组方程要解得准，得同时满足两个条件：
双波长法的联立方程和求解过程。四个消光系数（ε）缺一不可，DAR = C_Drug / C_mAb。
所以双波长法只在四个 ε 都可靠、样品又足够澄清时才用得上。
四个消光系数都已知时，双波长法的重复性很好：B7 成品 3 次重复测定，DAR 均值 8.23，RSD 0.21%，抗体浓度 RSD 0.17%。前提是四个 ε 值都准确。
这些限制同出一源：两个读数点的信息量太少。哪个读数点受了干扰，都没有别的数据来抵消误差。
所以 Stunner 采集 230–750 nm 全波段光谱，再用 Unmix 分离混合信号：
Unmix 工作原理：先将各组分的参考光谱存储在软件中，混合样品上机后，算法将原始光谱拆分为 α×组分 1 + β×组分 2 的线性组合，得到各组分的浓度。
全波段拟合由整段光谱共同约束结果，个别波长上的干扰被摊薄，不会像双波长法那样直接决定结果。各组分浓度由参考光谱拟合得出，也就不再需要四个消光系数。
峰位接近时靠峰形和肩峰区分。 Unmix 比对的是全波段光谱形状，峰位只是其中一个特征；只要峰形、肩峰、长波长区的衰减特征有差异，就拆得开。
ADC Quant 把 Unmix 用到了 DAR 上。先在 Stunner 软件中建立抗体和 payload 的参考光谱，组合为 ADC Analyte。
测样时，软件以最小二乘法将 ADC 总光谱拆为抗体、payload、浊度三部分，再按各自的摩尔消光系数反推浓度，由 payload 与抗体的摩尔浓度之比算出 DAR。
和双波长法相比，它的不同在于：
B7 成品的 ADC Quant 分析结果。上图：3 次重复测试的总吸收光谱高度重合。下图：光谱拆分后，黑色为总光谱，蓝色为蛋白（抗体），绿色为 linker-payload，黄色曲线为浊度（结果表中浊度的色块为灰色）。结果：payload 浓度 1.205 mg/mL，抗体浓度 19.7 mg/mL，DAR = 8.7，残差 2.1%。
批次间比较要固定方法。同一支 B7 成品，双波长法给出 DAR 8.23，ADC Quant 给出 8.7。前者靠四个 ε，后者靠实测参考光谱，两个数不能混着比。
ADC Quant 的前提是 payload 参考光谱。建法取决于 payload 是否溶于水，以及手头已知的是 DAR 还是 ε。
把已知浓度的 payload 母液直接上机测量，得到的就是参考光谱。
大多数 payload 疏水性强，不能溶在水里直接测，只能从 ADC 样品反推它的光谱：
#### 路径 A：已知 DAR 值（最推荐）
HIC 或 MS 是 ADC 开发中几乎必做的表征，所以大多数团队手里已有自己产品的 DAR 值。
- 用 HIC 或 MS 确定一批 ADC 的 DAR
- 将这批纯化的 ADC 作为参考品上 Stunner
- 软件用已知 DAR + 抗体光谱（分子量和 E1%）→ 反算出 payload 参考光谱
- 后续所有批次直接用 ADC Quant 测 DAR
不需要 payload 纯品、不需要 ε，只要一个 DAR 已知的参考品以及抗体的信息（光谱、分子量和 E1%）。
HIC/MS 与 Stunner 的分工。 HIC 和 MS 给出的是准确的参考 DAR，Stunner 据此建立 payload 光谱。光谱建好后，后续批次只要 2 µL 样品、十分钟左右就能出 96 个结果。HIC/MS 做一次基准，Stunner 承担后续所有批次的常规检测。
知道抗体的光谱（包括分子量和 E1%）以及 payload 在水相的摩尔消光系数，软件通过光谱拆分就能得到抗体和 payload 的摩尔浓度及 DAR 值，不必先做 HIC/MS。
同时上样 ADC 和对应的裸抗（未偶联的抗体）。软件先获得裸抗的光谱，再去匹配 ADC 的光谱，最终得到 payload 的光谱。得到的 payload 光谱纵坐标是 OD 值，不是摩尔消光系数，所以不能直接算 DAR。
三条路径都建出 payload Analyte，与 Antibody Analyte 组合后用于 ADC Quant。区别在刻度：A 和 B 的 payload 光谱带绝对浓度刻度，算得出 DAR；C 的纵坐标是 OD，只能做样品间的相对比较。推荐优先级：A > B > C。
没有 payload 纯品、不知道 ε、也没做过 HIC/MS 时，用 ADC Decode。
它只需要抗体光谱（以及分子量和 E1%）。ADC 上机后，蛋白浓度有一个可能的范围，上限是总吸光度全部归属蛋白时的浓度，下限是零。Decode 在这个范围内搜索：调用 Stunner 数据库中的蛋白光谱模型，利用色氨酸在 280–300 nm 区域的吸收特征找到最佳蛋白拟合。总光谱减去最优蛋白贡献、扣除浊度，剩下的就是 payload 光谱。
提供 payload 的 ε 和分子量，软件直接输出 DAR；不提供，则输出 Drug-Antibody Absorbance Ratio。这个比值不是绝对 DAR，但可以在同一管线内做工艺步骤间或批次间的相对比较，比如追踪偶联条件优化对 DAR 的影响趋势。
有 payload 的 ε 和分子量时：直接输出 DAR = 5.41 mol/mol。光谱中蓝色为抗体，绿色为 payload，灰色为浊度。
没有 payload 信息时：输出 Drug-Antibody Absorbance Ratio = 0.76 OD/OD，可用于样品间的相对排序和批间比较。
Decode 的定位：门槛最低的起步方案，适合早期候选分子筛选和工艺优化中的趋势追踪。拿到 HIC/MS 的 DAR 后，可以按路径 A 建谱，转用 ADC Quant 测绝对 DAR。
双波长法 / ADC Quant / ADC Decode
原理:双波长法 两波长联立方程;ADC Quant Unmix 光谱拆分;ADC Decode 残差归属
需抗体信息:双波长法 抗体在两个波长的 ε;ADC Quant 抗体光谱、分子量、E1%;ADC Decode 抗体光谱、分子量、E1%
需 payload 信息:双波长法 payload 在两个波长的 ε;ADC Quant payload 光谱（可间接导出）、分子量;ADC Decode 不需要
输出:双波长法 DAR;ADC Quant DAR;ADC Decode DAR（有 ε、分子量） / 吸光度比值（无 ε）
抗干扰:双波长法 低;ADC Quant 高;ADC Decode 中
多 payload:双波长法 仅单 payload;ADC Quant 单 / 双 / 多;ADC Decode 仅单 payload
复用性:双波长法 每次确认 ε;ADC Quant 一次建谱，长期调用;ADC Decode 无额外成本
用 Stunner 测 ADC 样品前，按测试目的准备以下材料。
### 只测 ADC 中抗体的浓度
- 分散在 buffer 中的 ADC 样品
- 抗体的相关资料：分子量，E1%（或 280 nm 处的摩尔消光系数）
### 既测抗体浓度，也测 DAR 值
- 分散在 buffer 中的 ADC 样品（必须是纯化后的），以及该 buffer
- 抗体的相关资料：分子量，E1%（或 280 nm 处的摩尔消光系数）
- payload 的相关资料：分子量
- 利用 HIC 或 LC-MS 得到的 average DAR 值