本实验用 3 种 payload × 2 种摩尔比构建 6 个 ADC 模型，偶联前后的换液和纯化都在 Unagi 上做，它一次可并行处理 8 个样品。偶联前 mAb 置换的回收率 >90%，偶联后纯化的 ADC 为 82–94%。表征交给 Stunner：同一个 2 µL 样品同时读出浓度、DAR、粒径和 PDI，不必为每一步各换一种方法。
ADC 由单抗（mAb）、连接子（linker）和小分子药物三部分组成。在筛选不同 payload 和反应条件时，每轮实验都涉及偶联→纯化→缓冲液置换→表征。传统做法在每一步都有短板：
层析/脱盐：需要多次缓冲液洗涤平衡，会稀释样品，拉长流程离心超滤：死端过滤模式，膜面浓度不均匀，容易造成聚集切向流过滤 (TFF)：适合大体积单样品，难以并行处理小规模筛选的多个样品HPLC 表征：DAR 测定的金标准，但耗时长、样品量大、每换一种 payload 就要重新优化方法
Unagi 是台式自动化缓冲液置换系统，用压力驱动的 UF/DF 技术一次处理 8 个样品。超声波体积监测实时控制流速和压力周期，所以置换时不额外稀释样品；本实验 mAb 在三种反应缓冲液中的回收率均 >90%。Stunner 在同一个 2 µL 样品上同时跑 UV/Vis 和 DLS，一次报告浓度、DAR、粒径和 PDI。
Unagi（A）自动化台式缓冲液置换系统。Stunner（B）UV/Vis + DLS 一体化平台，同一个 2 µL 样品同时出浓度和粒径数据。
Unagi 的压力驱动 UF/DF 流程：加样→超声波体积测量→加压过滤+混合→再次体积测量→补充新缓冲液→重复至目标置换率→可选浓缩步骤。偶联 mAb 被截留，未反应的 payload 和旧缓冲液组分被滤除。
人源 mAb（26.6 mg/mL，5 mM 琥珀酸钠，60 mM 海藻糖，pH 5.0）稀释至 10 mg/mL，14,000×g 离心，0.1 µm 过滤。1.1 mL 等份分别置换到三种反应缓冲液中：50 mM 硼酸盐（pH 8.5）、100 mM 碳酸氢盐（pH 8.3）和 PBS。
Table 1：mAb 缓冲液置换参数（10 kDa MWCO Unas）
Table 2：偶联组合
缓冲液 / Payload / 摩尔比
50 mM borate, pH 8.5:Payload Fluorescein isothiocyanate (FITC);摩尔比 2:1 和 10:1
100 mM bicarbonate, pH 8.3:Payload Alexa Fluor™ 350 NHS Ester;摩尔比 2:1 和 10:1
PBS:Payload Alexa Fluor™ 350 C5 maleimide;摩尔比 2:1 和 10:1
三种 payload 各自溶于 DMSO（10 mg/mL），加入对应缓冲液中的 0.5 mL mAb。Maleimide 反应加入 100 µg TCEP 作为还原剂。室温避光孵育 1 小时后，稀释至 1 mL，在 Unagi 上置换到 PBS 中。
Table 3：ADC 纯化缓冲液置换参数
Unagi 的 pre-dilute 和 concentrate 功能自动将样品从 1 mL 先稀释到 2 mL，再在置换结束后浓缩到 0.5 mL。
每种 payload 的 DMSO 溶液先 1:9 稀释到 PBS 中，再做 2X 系列稀释，用 Stunner 的 Store Analyte 功能存储光谱。mAb 光谱同样存储。E1% 从厂家文档或母液浓度获取。ADC + Sizing 应用同时测浓度、DAR、粒径和 PDI。DLS 设置：5 次采集 × 1 秒，自动去除离群值。四次重复。
FITC 和 NHS ester 需要碱性缓冲液才能标记赖氨酸残基和 N 端。在 Unagi 上，这步缓冲液置换只要几分钟的手动操作，加上不到 1 小时的无人值守运行。三种缓冲液中 mAb 的终浓度都在目标值 10 mg/mL 的 5% 以内，回收率均 >90%。
三种反应缓冲液中 mAb 的 A280 浓度和回收率。Borate 92%、Bicarbonate 97%、PBS 100%。误差线为 1 SD。
三种反应缓冲液中 mAb 的 Z-average 流体动力学直径（柱状图，左 Y 轴）和 PDI（灰色点，右 Y 轴）。直径 10–12 nm，PDI 均 <0.1，表明单分散、无聚集。
要用 UV/Vis 分析 ADC 的光谱，必须把抗体的吸收和偶联药物的吸收区分开。不同药物的光谱差异很大，所以仪器要先有每种药物的参考光谱。Stunner 的 Store Analyte 功能用于建立药物参考光谱：先跑一组药物的稀释系列存储光谱，再和 mAb 光谱一起用 Unmix 算法解卷积。蛋白浓度和药物浓度各自算出来，比值就是 DAR。
（A）Stunner Store Analyte 功能存储的 FITC 稀释系列 UV 光谱。（B）10:1 FITC:mAb 偶联产物在缓冲液置换后的 Unmix 解卷积：黑色=总吸收，绿色=mAb，蓝色=FITC，黄色=残差。
比较缓冲液置换前后的 DAR，可以同时判断偶联反应是否发生，以及纯化步骤去掉了多少未反应的 payload。
6 个 ADC 模型在 Unagi 纯化前（绿色）和纯化后（蓝色）的 DAR 值。底部标注回收率（%）、摩尔比和 payload 类型。纯化后 DAR 普遍高于阈值，说明标记确实发生了。阈值按完全没反应估算：96% 置换后，残留 payload 只应相当于纯化前 DAR 的 ~4%。
三种偶联化学的效率差异
纯化后的 DAR：FITC 在 2:1 和 10:1 下分别为 1.0 和 3.7，AF350 NHS ester 为 2.1 和 9.6，AF350 maleimide 为 1.1 和 2.1。AF350 NHS ester 在两种摩尔比下的 DAR 都高于其他组合，说明 NHS ester 化学与这种 mAb 的反应效率更高。NHS ester 和 maleimide 的靶点不同（ester → 胺基，maleimide → 巯基），反应速率和可及残基数量也不同。这 6 个 ADC 经 Unagi 纯化后的回收率在 82–94% 之间。筛选 payload 和偶联化学，目标之一就是找到同时满足目标 DAR、浓度和回收率的组合。
DAR 和回收率之外，还要确认偶联没有引起聚集。Stunner 在测浓度和 DAR 的同一个 2 µL 样品上同步跑 DLS，报告 Z-average 流体动力学直径和 PDI。
所有 ADC 模型的流体动力学直径与未偶联 mAb（10–12 nm）持平或略大。10:1 摩尔比的样品普遍比 2:1 的大，说明偶联更多 payload 确实增加了分子尺寸。Unagi 纯化后 PDI 普遍下降，说明去掉未反应的 payload 和缓冲液组分后样品更均一。
10:1 FITC:mAb 纯化后的 PDI 达到 0.15，可能存在轻微聚集。其他样品的 PDI 和粒径没有类似升高，偶联和缓冲液置换过程中没有看到聚集。
6 个 ADC 模型 + 未偶联 mAb（None）在 Unagi 纯化前（绿色）和纯化后（蓝色）的 Z-average 直径（柱状图）和 PDI（圆点）。
Unagi 在偶联前做缓冲液置换（换成反应缓冲液），偶联后做纯化（去掉未反应 payload + 换回储存缓冲液）。Stunner 在同一个孔里测浓度、DAR、粒径和 PDI，换一种 payload 只需要存储新的光谱，不用重新开发 HPLC 方法。DAR 和 PDI 在同一个孔里读出，像 10:1 FITC 这样 PDI 偏高的组合，纯化后就能挑出来复核。