紫外分光光度法 · 第 9 篇
2025 年版对紫外仪这条线动了两处：新增指导原则 9094，中国药典第一次有了自己的仪器确证框架；9101 方法验证做了结构性重构。按 ChP 放行时，厂商的 IQ-OQ-PV 方案交付仪器确证这一层；实验室除了常规工作，还要自己做吸光度准确度和杂散光两次复测。
中国药典对一台紫外仪的要求不在一条通则里。往下拆是三层：仪器要能测准、要有文件证明它装对跑对、用它建立的分析方法要经过验证。
还有一条容易被跳过：用紫外法测蛋白浓度，法定方法不在 0401，在通则 0731《蛋白质含量测定法》的第六法。0401 是它引用的方法基础。
0401 的适用范围是在 190～800 nm 波长范围内测定物质的吸光度。它的"仪器的校正和检定"项下只列了三项，这三项就是中国药典对紫外仪校正与检定的全部明文要求。
0401 给了四种可用的校正谱线或标准物质：汞灯、氘灯、钬玻璃、高氯酸钬溶液，各自的波长值通则里都列全了。高氯酸钬一项，0401 原文写的是“近年来，常使用高氯酸钬溶液校正双光束仪器”；对钬玻璃另有一句提醒：因来源不同或随时间推移会有微小变化，使用时应注意。
允许误差原文只有一句：紫外光区 ±1 nm，500 nm 附近 ±2 nm。这一句常被只引后半截，而 280 nm 测蛋白落在紫外光区，适用的是 ±1 nm 那一档。
用重铬酸钾的硫酸溶液检定，在规定波长处测定并计算吸收系数，与下表比较。注意它给的是吸收系数的许可范围，不是吸光度的绝对容差。
波长 / nm / 235（最小） / 257（最大） / 313（最小） / 350（最大）
吸收系数规定值:235（最小） 124.5;257（最大） 144.0;313（最小） 48.6;350（最大） 106.6
吸收系数许可范围:235（最小） 123.0～126.0;257（最大） 142.8～146.2;313（最小） 47.0～50.3;350（最大） 105.5～108.5
按下表所列的试剂和浓度配成水溶液，置 1 cm 石英吸收池中，在规定波长处测定透光率。这一项中国药典点名了试剂、浓度和波长，判的是透光率。
试剂 / 浓度 /%（g/mL） / 测定用波长 / nm / 透光率 /%
碘化钠:浓度 /%（g/mL） 1.00;测定用波长 / nm 220;透光率 /% < 0.8
亚硝酸钠:浓度 /%（g/mL） 5.00;测定用波长 / nm 340;透光率 /% < 0.8
0401 的测定法项下写得很具体：除另有规定外，采用 1 cm 的石英吸收池，以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照。
两句常被引用的经验值也在这里：一般以在 0.3～0.7 之间为宜；狭缝波带宽度宜小于供试品吸收带半高宽度的 1/10。0401 通则里没有分辨率测试，对光谱分辨能力的要求只有狭缝带宽这一句。
0401 管的是紫外-可见分光光度法这台仪器和这个方法本身的规矩。用它测蛋白浓度，法定依据在通则 0731《蛋白质含量测定法》。0731 收了六法：凯氏定氮法、福林酚法（Lowry 法）、双缩脲法、2,2′-联喹啉-4,4′-二羧酸法（BCA 法）、考马斯亮蓝法（Bradford 法），以及第六法 紫外-可见分光光度法。
所以两条通则要合起来看：0731 第六法给法定地位和核酸校正式，0401 给仪器和方法本身的规矩。
第六法原文：本法系依据蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，其在 280 nm 波长处有最大吸光度，在一定范围内其吸光度大小与蛋白质浓度呈正比。
测定法项下写：照紫外-可见分光光度法（通则 0401），在 280 nm 处测吸光度，以吸收系数法或对照品比较法计算含量。另一条路径用于供试品溶液中存在核酸时，在 280 nm 与 260 nm 处各测一次，按下式计算：
蛋白质浓度（mg/mL）= 1.45 × A₂₈₀ − 0.74 × A₂₆₀
这组系数和本系列蛋白定量那篇介绍的经典核酸校正式不同；按药典放行时，用 0731 给的系数。
0731 对第六法的定位很直接，原文照录：本法操作简便快速，适用于纯化蛋白质的检测，一般供试品浓度为 0.2～2 mg/mL。紧接着一句：本法准确度较差，干扰物质多。
0.2～2 mg/mL 是 0731 给这条法定路径划的适用区间，和仪器的动态范围是两回事。Lunatic 能测的浓度不限于这个区间；区间外的数据要用于放行，需要在品种项下另行规定。
这是 2025 年版在这条线上最实的变化。此前中国药典没有一套自己的仪器确证术语体系。2025 年版新增了指导原则 9094《分析仪器确证》，把 DQ / IQ / OQ / PQ 四阶段写进了药典，并把 URS（用户需求说明书）定为"整个分析仪器确证活动的基准点"。
B 类和 C 类的分界线是有没有软件。Lunatic 和 Stunner 这类由客户端软件控制采集、出报告、存数据的平台，落在 C 类，走完整四阶段，确证要覆盖硬件和软件两侧。
9094 里另有一条对采购很实用：原文写"一般在市售非定制仪器出厂前，制造商已经完成设计和生产，因此此类仪器的 DQ 可以简化"。
客户常问：买了完整的 DQ/IQ/OQ/PQ，是不是放行就绪了？9094 的回答是否定的。原文把分析仪器确证、分析方法验证、系统适用性试验、质控样核查四个要素叠成数据质量金字塔，并写明：
分析仪器确证位于数据质量金字塔的底部，是产生数据质量的基础，是分析测试结果的保证。
所以仪器确证只是塔基，上面三层由实验室完成。这是药典定的结构，不管买哪家的仪器，厂商能交付的都只是塔基这一层。
三层里的最后一层是 9101 分析方法验证，2025 年版把原来的八项验证清单重构成四个性能特征。其中 9101 对准确度和精密度没有给通用的接受限，限度由申报方按品种自定并论证。这一层由实验室完成，见下面的清单。
把前面几条通则放到一起，放行要做的事可以按执行方分成下面三部分。
Lunatic 和 Stunner 的紫外部分是同一套，共用一份 IQ-OQ-PV 方案（文号 Doc-CO-0024 rev. 4.0 挂在 Lunatic 名下，本文引用的验收标准都出自它）：IQ 按硬件、文档、环境、软件、开机与通讯五节走 27 步核验；OQ 分仪器内部诊断和 OD check 两层；PV 用认证标准物质（CRM）跑六项测试。执行流程细节另有一篇。
项目 / 药典依据 / 说明
IQ 安装确证:药典依据 9094;说明 27 步核验：硬件 / 文档 / 环境 / 软件 / 开机与通讯
OQ 运行确证:药典依据 9094;说明 仪器内部诊断（泵压 / 波长 / 板位校准）加 OD check 端到端验证
PQ 的仪器指标层:药典依据 9094;说明 PV 六项 CRM 测试（见下表）
DQ 设计确证:药典依据 9094;说明 实验室提 URS，供应商回技术指标。9094 原文写明，市售非定制仪器的 DQ 可以简化
PV 那一项展开看，六项的验收标准逐项对上 0401 是这样：
PV 测试项 / CRM / 方案的验收标准 / ChP 0401 对应
波长准确度:CRM 高氯酸钬（UV5）;方案的验收标准 < 400 nm：±1 nm 400–750 nm：±2 nm;ChP 0401 对应 紫外 ±1 nm、500 nm 附近 ±2 nm。数值一致
吸光度准确度:CRM 重铬酸钾（UV20/60/120）;方案的验收标准 < 1 A：±0.01 A 1–2 A：±1%;ChP 0401 对应 吸收系数许可范围。判据形式不同，见下文"因为按 ChP 放行而多出来的两次实验"
吸光度精密度:CRM 同上;方案的验收标准 < 1 A：SD ≤ 0.005 A 1–2 A：RSD ≤ 0.5%;ChP 0401 对应 0401 未要求此项
吸光度线性:CRM 同上（4 波长：235 / 257 / 313 / 350 nm）;方案的验收标准 R² ≥ 0.999;ChP 0401 对应 0401 未要求此项
杂散光:CRM 丙酮（UV19）;方案的验收标准 A ≥ 3.0;ChP 0401 对应 同一项性能，0401 用另一套试剂，判据也建在 1 cm 池上
分辨率:CRM 甲苯的正己烷溶液（UV6）;方案的验收标准 269 / 266 峰谷比 ≥ 1.3;ChP 0401 对应 0401 未要求此项
PV 六项和 0401 的关系分三种。波长准确度的数值两边一致：紫外区都是 ±1 nm；可见区方案对 400–750 nm 整段用 ±2 nm，0401 只写了 500 nm 附近 ±2 nm，前者覆盖后者。
精密度、线性、分辨率是 0401 没要求、方案主动多做的，其中分辨率正好补上 0401 通则里的空白。剩下吸光度准确度和杂散光两项，差别在判据形式和试剂上，见下文"因为按 ChP 放行而多出来的两次实验"。
跑完后结果连同附件装成一整本：IQ / OQ 结果写在协议册正文，PV 六份独立报告，加上所有 CRM 的原始证书。每一步核验都由执行工程师签名签日期，每个测试小节的结论框里另有一个供客户签收的 Customer Verification 字段，所以整本记录可以逐步追溯。
方案里还有一项 Fundamentals Check。前面六项用的是物理 CRM，这一步改用 L-色氨酸五点梯度，在客户仪器上跑准确度、精密度、线性。色氨酸正是蛋白在 280 nm 吸光的主要贡献者之一，所以证据从物理 CRM 延伸到了生物分子的浓度测量。
这几项由实验室执行，和选哪台紫外仪无关，是 GMP 实验室对任何仪器、任何分析方法都要做的常规工作。
项目 / 药典依据 / 说明
URS 用户需求说明书:药典依据 9094;说明 9094 定它为整个确证活动的基准点，采购论证阶段就要有
PQ 的周期性复测:药典依据 9094;说明 复测周期和判据按实验室自己的 SOP 定
软件系统验证:药典依据 9094;说明 C 类要覆盖硬件和软件两侧。软件的 Audit Trail 等电子记录功能，Unchained Labs 另有一份独立的 21 CFR Part 11 确证协议（Doc-CO-0023）可以覆盖到；系统验证本身按实验室的计算机化系统规程做
分析方法验证:药典依据 9101;说明 9101 不给通用接受限，限度按品种自定并论证
品种项下的方法参数:药典依据 各论 / 0731;说明 光程、浓度区间这类都在这一层写明
这两项的共同点是：0401 点名了自己的试剂，其中一项连基质都写明了，而 PV 套装的标准物质配法与之不同。所以 PV 数据换算后不能用来判定，要实验室按 0401 配液，在仪器上复测。
项目 / 药典依据 / 说明
吸光度准确度的判据:药典依据 0401;说明 PV 数据折算不过来，要按 0401 自己配液复测。同是重铬酸钾，但 PV 的 CRM 溶在 0.001 N 高氯酸里，0401 那张表是给 0.005 mol/L 硫酸溶液定的
杂散光的检查条件:药典依据 0401;说明 要按 0401 自己配液测。PV 套装里没有碘化钠和亚硝酸钠这两个标准物质
吸光度准确度：两边用的都是重铬酸钾，但配法不同。PV 的标准物质是溶在 0.001 N 高氯酸里的认证比色皿，而 0401 那张吸收系数表，是给 0.005 mol/L 硫酸溶液定的。基质不一样，那张表的数就不能拿来判 PV 的读数。
把 PV 的认证吸光度按 0401 的公式算一遍，就能看出问题。同一个波长，UV20 / UV60 / UV120 三个浓度会算出三个不同的吸收系数，彼此差 1～2%。0401 在 257 nm 的许可带总共才 2.4% 宽。换算带进来的离散和判据本身是同一个量级，这个判定就立不住。
杂散光：PV 走丙酮法（CRM 货号 UV19），接受标准 A ≥ 3.0。丙酮在 250～330 nm 几乎全吸收，仪器在这一段还能读出多高的 A，直接反映漏进检测器的杂散光有多少。Unchained Labs 在 8 台仪器上的验证结果：260 nm 3.8 A（杂散光 0.02%）、280 nm 3.6 A（0.03%）、300 nm 3.7 A（0.02%），全部通过。
0401 点名的则是 1.00% 碘化钠（220 nm）和 5.00% 亚硝酸钠（340 nm），判透光率。两者查的是同一项仪器性能，但试剂、波长、判据形式都不同；220 nm 处和 260 nm 处的杂散光本来也是两个量，所以数据不能直接互换。
两项复测都不需要改造仪器，因为 PV 六项跑的是 10 mm 密封石英比色皿，装在专用的比色皿板上，和测样品用的微量板是两条光路。
也就是说，这台仪器本来就有和 0401 默认的 1 cm 对得上的光路，不存在光程上的硬障碍。自配的溶液具体用什么池子承载，在方法开发阶段和厂商确认即可。0401 三项里的波长一项，可以直接引用 PV 结果。
仪器确证这一层由厂商的 IQ-OQ-PV 方案交付。URS、方法验证、品种项下参数是实验室的常规工作，换哪台仪器都一样。真正因为按 ChP 而多出来的，是两次实验室要自己做的复测：吸光度准确度，按 0401 称重铬酸钾、用 0.005 mol/L 硫酸配液复测一次；杂散光，按 0401 配 1.00% 碘化钠和 5.00% 亚硝酸钠测一次。两次只需配试剂，仪器不用改。
中国药典 2025 年版四部：通则 0401 紫外-可见分光光度法、通则 0731 蛋白质含量测定法、指导原则 9094 分析仪器确证、指导原则 9101 分析方法验证. · Unchained Labs, Lunatic Installation & Operational Qualification & UV/Vis Performance Verification, Doc-CO-0024 rev. 4.0 (09/2024). · 21 CFR 211.194(a)(2).
说明：药典条文与数值逐字核对 2025 年版四部原文。PV 测试项、CRM 货号与验收标准引自上述 Unchained Labs 方案文件；该文件是厂商执行协议，未逐条声明符合某部药典的某一条文，文中与 0401 的对照系将方案验收标准与通则条文并置比较所得。