紫外分光光度法 · 第 6 篇
实验室里的蛋白样品经常浑浊：纯化早期的上清、冻融后的抗体制剂、LNP 样品、高浓度抗体、离心没离干净的样品。测这类样品的 A280，散射会把算出的浓度抬高。Mach 1992 统计的蛋白里，散射分量多数不超过 2%，晶状体蛋白可达 7%。抬高的原因在仪器：它分不清散射和吸收，把散射也算进了吸收。处理办法有 330 nm 校正、二阶导数光谱和物理过滤，各有自己的物理前提和适用样品。
吸收和散射在物理上是两种过程。吸收是分子把光子的能量接收下来，用来让电子跃迁到高能级，最后以热或荧光释放。散射是光子遇到颗粒或分子后改变传播方向，能量本身没变。紫外分光光度计的检测器只数到达的光子有多少，所以没到达的光子是被吸收了，还是被偏转到其他方向，它分不清。
散射有多强，取决于波长。对远小于波长的颗粒，散射服从瑞利散射规律：光强与波长的四次方成反比，即 I ∝ λ⁻⁴。按这个规律，280 nm 的散射是 560 nm 的 16 倍，约是 330 nm 的 2 倍。波长越短散射越强，而蛋白的吸收峰恰好在短波紫外区，所以 A280 受散射影响最大。
蛋白本身在 320-350 nm 区间几乎没有吸收。所以在这个"应该平坦"的区域测到可读的吸光度，就是散射的标志。Pace 1995 给了一个经验判断：溶液在 325 nm 以上还能读出吸收，就是散射在干扰。Mach 1992 也观察到，散射会在 280 nm 处产生一个表观吸光度，仪器把它算成吸收。
A330 因此成了天然的散射诊断波长：读数明显高于零，就说明散射在干扰你的 A280。
图 1 · 左：瑞利散射的 λ⁻⁴ 曲线，280 nm 散射强度约是 330 nm 的 2 倍、560 nm 的 16 倍。右：测量光谱、散射基线和校正后光谱的关系，A₂₈₀（真）= A₂₈₀（测）− 1.929 × A₃₃₀。
Pace 1995 比较了多种蛋白消光系数测定方法，同时给出了一个散射校正公式：
A₂₈₀（真）= A₂₈₀（测）− 1.929 × A₃₃₀
1.929 这个因子来自瑞利散射的 λ⁻⁴ 规律：(330/280)⁴ ≈ 1.929。如果测量波长是 278 nm，校正因子变为 1.986 × A₃₃₀。
快速估算时，Pace 还给了更简便的近似：2 × A₃₃₃ ≈ 280 nm 处的散射贡献，或 2 × A₃₃₁ ≈ 278 nm 处的散射贡献。
散射校正的幅度有多大？Mach 1992 用了 32 个蛋白的实测数据，结果大致是：
β-乳球蛋白校正后的 ε 是 16,650 M⁻¹cm⁻¹，文献里常见的未校正值是 17,550，差了约 5%。做精密定量时，这个差距已经不能忽略。
但这个公式有个前提：它假设散射是纯瑞利散射，即颗粒直径远小于光波长。如果浑浊来自大颗粒聚集体、可见沉淀、或脂质纳米颗粒，λ⁻⁴ 规律不成立，1.929 这个因子会失效。Pace 1995 也写明，这几个简化算法都假设散射强度与波长四次方成反比。遇到这类样品，应该改用物理过滤，不要硬套公式。
如果散射背景不是简单的 λ⁻⁴ 规律，或者样品光谱复杂、有多个重叠峰，二阶导数光谱是另一条路。
它利用的是两者曲率的差别。散射随波长变化很慢，求二阶导数后几乎变平；蛋白吸收是尖锐的峰，求导后仍有明显的负峰或正峰结构。所以求导能把背景拉平，峰反而更明显。
导数光谱能进入日常使用，靠的是 Savitzky 和 Golay 1964 年的一篇论文。他们提出把多项式最小二乘拟合转化为卷积运算。做法是用 2m+1 个连续数据点拟合 n 次多项式（n <2m+1），每个窗口对应一组整数系数。光谱数据与这组系数做卷积求和，就得到平滑后或求导后的值。
简单移动平均会压低峰值；简单差分对噪声敏感，会放大毛刺。Savitzky-Golay 用最小二乘拟合代替直接平均，平滑后的峰形基本不失真。
窗口和多项式次数要按光谱来选：
导数光谱适合几类场景：
代价是对信噪比敏感，需要足够强的原始信号。它的计算量比 330 nm 校正大，但现代仪器软件已内置这一步。
如果散射来自真实颗粒，最直接的办法是把颗粒去掉。
Pace 1995 在干重法和 Edelhoch 法前都用 0.2 µm Acrodisc 过滤膜过滤样品。
过滤适合有可见颗粒、气泡多、离心沉不下去的聚集体。
以下样品不宜过滤：
这些样品可以改用下面的办法：
样品特征 / 推荐方法 / 注意点
A₃₃₀ 轻微升高，样品澄清:推荐方法 Pace 330 nm 校正;注意点 快速，不改变样品
A₃₃₀ 明显升高，有可见颗粒:推荐方法 0.2 µm 过滤或离心;注意点 过滤有吸附损失风险
散射规律不明（非瑞利散射嫌疑）:推荐方法 二阶导数光谱;注意点 需要信噪比足够
光谱复杂，多组分重叠:推荐方法 二阶导数光谱;注意点 分辨 Trp/Tyr 精细结构
低浓度、易吸附、样品珍贵:推荐方法 离心 + 330 nm 校正;注意点 避免膜接触
同时怀疑聚集（不仅是散射）:推荐方法 Stunner DLS 联用;注意点 区分"有颗粒"vs"单纯散射"
图 2 · 三种方法的横向对比（330 nm 校正 / 二阶导数光谱 / 物理过滤）。另附决策流：按 A₃₃₀ 和可见颗粒判断走哪条路。
微量板式紫外仪一次读完全光谱，A330 随读数一起给出，不用像传统分光光度计那样换波长再手动算。
Lunatic 和 Stunner 每次测 A280/A260 时同时读出 A330，软件可直接显示散射校正后的 A280。Protein (Turbidity) 应用按瑞利散射与波长的关系，在全光谱上扣除散射，不只用 330 nm 一个点。
Stunner 多一层诊断：同一次测量里还测 DLS（动态光散射），能直接判断样品里有没有颗粒或聚集。A330 升高可能来自散射，也可能来自其他因素，DLS 可以把两者分开。DLS 显示有颗粒，就回到制备环节优化工艺或加一步过滤；DLS 干净，A330 升高多半另有来源，先查缓冲液和杂质的吸收，不要直接套散射校正。
Lunatic 的参数：96 通量、每孔 2 µL、光程 0.5 mm 或 0.1+0.7 mm。样品少到不便过滤时，离心后取上清，再用 330 nm 校正。
Pace C. N., Vajdos F., Fee L., Grimsley G., Gray T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Science 1995, 4, 2411-2423. · Mach H., Middaugh C. R., Lewis R. V. Statistical Determination of the Average Values of the Extinction Coefficients of Tryptophan and Tyrosine in Native Proteins. Analytical Biochemistry 1992, 200, 74-80. · Savitzky A., Golay M. J. E. Smoothing and Differentiation of Data by Simplified Least Squares Procedures. Analytical Chemistry 1964, 36(8), 1627-1639.