紫外分光光度法 · 第 5 篇
做分子生物学的人，纯化完一管质粒、RNA 抽提完一次，下意识的动作是测 A260。读数乘以 50 得 ng/µL（DNA）、乘以 40 得 RNA 浓度。然后看 A260/A280 比值：1.8 算 DNA 纯，2.0 算 RNA 纯。但这两个数字是物理常数还是经验值？Wilfinger 1997 年的实验给了一个反例：同一管 RNA，换一杯水稀释，比值就能从 1.55 变到 1.97，而样品纯度完全没变。
在 260 nm 附近，蛋白的吸收比 280 nm 处弱，核酸的吸收却最强。核酸的吸光来自嘌呤和嘧啶这两类碱基，它们的芳香共轭环在 260 nm 附近有强吸收。
但四个 DNA 碱基的峰位和吸收强度并不一样：
碱基 / 单链里的峰位 λ_max / 单碱基 ε₂₆₀(10³ M⁻¹·cm⁻¹)
A（腺嘌呤）:单链里的峰位 λ_max 256.7 nm;单碱基 ε₂₆₀(10³ M⁻¹·cm⁻¹) 15.4
C（胞嘧啶）:单链里的峰位 λ_max 265.7 nm;单碱基 ε₂₆₀(10³ M⁻¹·cm⁻¹) 7.4
G（鸟嘌呤）:单链里的峰位 λ_max 247.3 nm;单碱基 ε₂₆₀(10³ M⁻¹·cm⁻¹) 11.5
T（胸腺嘧啶）:单链里的峰位 λ_max 265.1 nm;单碱基 ε₂₆₀(10³ M⁻¹·cm⁻¹) 8.7
数据来自 Tataurov 等人 2008 年在 202 条合成短单链上的实验。
A 和 G（嘌呤）的 ε 比 C 和 T（嘧啶）高，约为后者的 1.3–2 倍。所以一段 DNA 的 A260 除了和长度成正比，还和碱基组成有关：G 多、A 多的序列 A260 高；C 多、T 多的序列 A260 低。
整段核酸的 A260，近似等于每个碱基 ε 乘以其数量的加和。相邻碱基会互相影响，所以实际计算时再用"最近邻（nearest-neighbor）模型"修正。这是 Tataurov 论文和 IDT / Thermo / NEB 等寡核苷酸合成公司网站"从序列算 ε"计算器背后的方法。
图 1 · 四个 DNA 碱基（A/C/G/T）的紫外吸收光谱。嘌呤（A、G）的 ε 约为嘧啶（C、T）的 1.3–2 倍，峰位略有差异。底部展示单链退火成双链时的减色效应（hypochromism）及其 AT/GC 系数。
实验室最常用的"快速算浓度"经验公式：
A260 × 50 = dsDNA 浓度（ng/µL）A260 × 33 = ssDNA 浓度（ng/µL）A260 × 40 = RNA 浓度（ng/µL）
Lunatic、Stunner 等微量紫外仪默认就带这三个因子。它们由两层物理决定。
把"平均"一条 DNA 序列（A/C/G/T 各占 25%）代进四碱基 ε，并计入相邻碱基的相互作用。再除以一个平均碱基的分子量（330 Da），大致就得出 1 AU @ 260 nm 对应 50 ng/µL dsDNA 这个数字。
真实序列的碱基组成不会正好平均，所以会偏离这个值，典型偏差 5-10%。GC 含量特别高或特别低的序列（比如线粒体 DNA、细菌某些基因组区段），默认 50 这个因子的偏差会更大。要高精度定量（特别是寡核苷酸），应该用实际序列算 ε，不用通用因子。
把两条互补单链退火成双链，A260 读数会下降，这个现象叫减色效应（hypochromism）。原因是相邻堆叠碱基之间有电偶极-诱导电偶极相互作用，整体吸收因此比两条单链之和小。
Tataurov 2008 在 86 条 10–60 bp 合成双链上实测出一个简单规律：
h(260) = 0.287 × f_AT + 0.059 × f_GC
其中 f_AT 是 AT 碱基对比例，f_GC 是 GC 碱基对比例。dA–dT 碱基对减色 29%，dG–dC 只减 5.9%，AT 富集序列比 GC 富集序列减色大约 5 倍。
减色效应解释了 dsDNA 的转换因子（50 ng/µL per AU）为什么比 ssDNA（33 ng/µL per AU）高：双链的 ε 小，所以同一浓度 dsDNA 的 A260 更低；反过来，1 AU 对应的 dsDNA 质量就多。
RNA 是单链，但碱基组成和 DNA 不完全一致（T 换成 U），二级结构又带来轻微减色，所以 40 这个因子居于两者之间。
1942 年，Warburg 和 Christian 提出用 A260/A280 比值评估蛋白制品中的核酸污染。核酸在 260 nm 的 ε 比蛋白大，所以比值越高，说明蛋白被核酸污染得越多。
分子生物学兴起后，这个比值被反向使用：核酸纯化后测比值，判断"有没有蛋白残留"。Sambrook 分子克隆手册给出的经验值是：
比值低于这个范围，提示有蛋白或酚类残留，因为它们在 280 nm 吸收大，会把比值拉低。这套判据随手册进了几乎所有实验室的 SOP。
但 1.8 和 2.0 只是经验值：它们会随稀释液的 pH 和离子强度浮动，浮动幅度足以改变纯度判断。
1997 年，Wilfinger、Mackey 和 Chomczynski 做了一个只改稀释用水的实验，结果说明这条判据离不开测量溶液的条件。
他们拿同一管 RNA 样品，分别用四种不同来源的"纯水"稀释，然后测 A260/A280 比值：
水源 / pH / A260/A280 比值
双蒸 + 单柱去离子:pH 6.10;A260/A280 比值 1.97
商品 HPLC 级纯水:pH 5.47;A260/A280 比值 1.69
单蒸 + 四柱去离子:pH 5.31;A260/A280 比值 1.57
单蒸:pH 5.20;A260/A280 比值 1.55
同一管 RNA，纯度完全没变，只是换水。比值从 1.55 一直变到 1.97。按"1.8 = 纯、低于就是有蛋白"的判定，完全相同的样品会得出完全不同的结论。
Wilfinger 接着把 pH 和离子强度分开考察，发现pH 是主因。按论文的概括，RNA 溶在 1 mM Na₂HPO₄（pH 8.5）里，A260/A280 约 2.0；溶在 pH 约 5.4 的水里，约为 1.5。这组数来自 pH 梯度实验，和上表的四种水不是同一批测量。
这一变化与蛋白无关，来自核酸碱基本身的吸收光谱对 pH 敏感：嘌呤和嘧啶在不同 pH 下质子化状态不同，共振结构改变，UV 吸收光谱随之变化。
Wilfinger 的光谱扫描显示，pH 升高时 A280 下降最明显，A260 只轻微下降。分母降得比分子多，A260/A280 于是上升。同时 RNA 的吸收峰从 260 nm 蓝移到 258 nm，pH 8 时"A260"读在峰顶长波侧 2 nm 处。这个移位很小，一般实验室不必处理。
图 2 · 同一管 RNA 样品在不同 pH 稀释剂下的 A260/A280 比值。pH 从 5.2 上升到 8.5，比值从 1.55 变到 2.0，而样品纯度完全未变。按传统'1.8 = 纯'的判定，相同样品会得到相反的结论。
Wilfinger 同时测了 NaCl 浓度效应：NaCl 从 0.1 mM 加到 1000 mM，A260 和 A280 都下降，A280 降得更多，比值从 1.53 升到 2.13。换成醋酸钾或 EDTA 也一样，说明效应不是 Na⁺ 特有的。所以离子强度会影响 A260 绝对值，进而影响算出来的浓度（不只是比值）。
同一样品在水里测和在缓冲液里测，算出的 ng/µL 不一样，原因就在这里。
另一个常用比值是 A260/A230，用于判断有机试剂和糖类残留。
这是因为 230 nm 附近正是几类常见核酸提取试剂的吸收带：
经验值：纯核酸 A260/A230 ≈ 1.8-2.2。低于 1.8 提示有一种或几种有机残留。和 A260/A280 一样，这也是经验值，多少算"干净"取决于样品类型和提取方法。
微量板式紫外仪测核酸的优势和 A280 测蛋白一样：样品走一次性微流控通道，不用换比色皿，全光谱一次读完。
Lunatic 和 Stunner 出厂都预装 dsDNA、ssDNA、RNA、寡核苷酸四种通用模式，各带转换因子（50 / 33 / 40 / 自定义）。读数时自动给出浓度、A260/A280 和 A260/A230。每孔只用 2 µL 样品，Lunatic 单板 96 通量，几分钟读完全板。
做高精度寡核苷酸定量时，可以切到自定义模式，输入按真实序列算出的 ε，避开通用因子带来的 5-10% 偏差。Stunner 还在同一次测量里输出 DLS 数据，能直接看样品里有没有颗粒或聚集；A330 和 DLS 是两个互补的散射判据。
Wilfinger 的 pH 8 缓冲液建议在微量板式仪上同样适用：上样前用 1 mM Na₂HPO₄ pH 8 稀释样品，不直接用水，比值会更稳。
Wilfinger W. W., Mackey K., Chomczynski P. Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity. BioTechniques 1997, 22(3), 474-481. · Tataurov A. V., You Y., Owczarzy R. Predicting ultraviolet spectrum of single stranded and double stranded deoxyribonucleic acids. Biophys. Chem. 2008, 133, 66-70. · Desjardins P., Conklin D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. 2010, 45, e2565. · Warburg O., Christian W. Isolation and crystallization of enolase. Biochem. Z. 1942, 310, 384-421. · Cavaluzzi M. J., Borer P. N. Revised UV extinction coefficients for nucleoside-5′-monophosphates and unpaired DNA and RNA. Nucleic Acids Res. 2004, 32, e13. · Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.