紫外分光光度法 · 第 2 篇
教科书上的 A = εcb 标着 Beer-Lambert 定律。最早写出指数衰减方程的是 1729 年的 Bouguer，定律的名字里却没有 Bouguer。严格说，这条式子也只是稀溶液下的一个好用近似。高吸光度下它开始失效，常规仪器的可靠工作区止于 A = 1.5，这个上限主要由杂散光决定。
这条公式花了 184 年才定型，中间跨了三个世纪。起点是 Bouguer 1729 年的第一个指数方程，终点是 Luther 1913 年给出的 A = εcb。
法国光学家 Pierre Bouguer 研究大气光学时，最早用数学描述了这件事。光通过一层均匀介质，路径每增加一段，强度就按指数衰减一次。写成方程：
I = I₀ · exp(−α · b)
其中 I₀ 是入射光强度，I 是透过后剩下的光强度，b 是路径长度，α 是与介质性质有关的常数。这是整条定律的原始形式。关键是：光穿过介质时，透过强度按 指数衰减。每走 1 个单位，剩下的光就按同一比例再打一次折：走 1 个单位剩 50%，走 2 个单位剩 25%，走 3 个单位剩 12.5%。
瑞士出生、在德国工作的数学家 Johann Heinrich Lambert 写了《光度学》（Photometria）。Lambert 在书里把 Bouguer 的工作系统化、数学化。Lambert 没有发现新现象，但他把 Bouguer 原本散乱的工作整理成了光度测定学的基础。
因为 Lambert 推广得广，后来的人大多只记住 Lambert，把更早的 Bouguer 忘了。
又过了 92 年，德国物理学家 August Beer 在《物理学年鉴》（Annalen der Physik）发表了一篇论文。题目是《有色液体对红光吸收的测定》。Beer 测了几种有色溶液在红光下的穿透行为，得出的核心经验关系是：
穿过液体的光强，不只取决于路径，还取决于溶液中有色物质的浓度。浓度越高，光减弱得越厉害。
Beer 把浓度这一项补进 Bouguer-Lambert 的方程，组合起来：
I = I₀ · exp(−k · c · b)
但 Beer 的论文有两个常被忽略的点：
所以严格说，Beer 贡献了一个想法（浓度线性），但完整的数学表达式在 Beer 手里并没有定型。
又过了 61 年。到 1913 年，德国化学家 Robert Luther 把整条方程写成我们今天课本上看到的样子：
A = log₁₀(I₀ / I) = ε · c · b
这里的两个关键改变：
从 1729 到 1913，184 年。如果把真正有贡献的人都写进去，这条定律更准确的叫法是 Bouguer-Beer-Lambert 定律。Mayerhöfer 2020 年那篇梳理完整历史的综述，标题里用的就是这个叫法。
教科书里的简化版"Beer-Lambert"删掉了最早的 Bouguer，只剩后来的两个名字，这是沿用下来的习惯。
图 1 · 从 1729 Bouguer 到 1913 Luther，定律花了 184 年才定型。每个节点的方程反映当时的进展：Bouguer 给路径、Beer 给浓度、Luther 给对数形式和 ε。
说完定律的来历，再看公式本身：
A = ε · c · b
定义：A = log₁₀(I₀ / I)。I₀ 是入射光强度，I 是透射光强度。A 没有单位，是无量纲的对数比值。典型数值 0.1（弱吸收）到 1.5（接近仪器上限）之间。
换算成透过率 T = I/I₀:A = −log₁₀(T)。几个常用对应关系：
吸光度 A / 透过率 T / 物理意义
0.0:透过率 T 100%;物理意义 样品完全透明
0.3:透过率 T 50%;物理意义 一半光被吸收
1.0:透过率 T 10%;物理意义 90% 光被吸收
2.0:透过率 T 1%;物理意义 99% 光被吸收
3.0:透过率 T 0.1%;物理意义 99.9% 光被吸收
每升高 1 个吸光度单位，透过率就变为原来的 1/10。所以 A 是一个对数，从 0 到 3 这么小的数字跨度，背后是光强 1000 倍的差距。
最不直观的一个字母。定义：在特定波长下，1 mol/L 的溶液，放在 1 cm 光程的比色皿里，测得的吸光度。单位：L·mol⁻¹·cm⁻¹（或写成 M⁻¹·cm⁻¹）。
ε 是分子的固有属性：在稀溶液、构象不变时，同一分子在同一波长下的 ε 近似恒定，和用哪台仪器无关。溶液条件、变性、聚集都会改变它，下文第三类偏离就是聚集的例子。典型值：
分子 / 残基 / 波长 / ε
色氨酸（Trp）:波长 280 nm;ε 5500 M⁻¹·cm⁻¹
酪氨酸（Tyr）:波长 280 nm;ε 1490 M⁻¹·cm⁻¹
二硫键（cystine）:波长 280 nm;ε 125 M⁻¹·cm⁻¹
腺嘌呤（dAMP）:波长 260 nm;ε 15,400 M⁻¹·cm⁻¹
典型 IgG:波长 280 nm;ε ~210,000 M⁻¹·cm⁻¹
大蛋白的 ε 远大于小分子，因为蛋白里每个发色基团的 ε 是可加的。IgG 分子大，含有大量 Trp 和 Tyr，把它们各自的 ε 加起来就是蛋白的总 ε。
这就是为什么蛋白的 ε 可以"算出来"。Pace 1995 的那条公式，背后就是"每个 Trp 贡献 5500、每个 Tyr 贡献 1490、每个二硫键贡献 125"的简单相加。
如果 ε 用的是 M⁻¹·cm⁻¹，c 就必须用 mol/L（摩尔浓度）。生物实验室经常嫌 mol/L 麻烦，于是用 mg/mL 的版本。这时 ε 换成 (mg/mL)⁻¹·cm⁻¹，数值上是 M⁻¹·cm⁻¹ 除以分子量。
还有一个常用简写 E1cm1%，意思是"1% 溶液（即 10 mg/mL）在 1 cm 光程下的吸光度"。人 IgG 常用的 E1cm1% 是 13.7，等价于 ε = 1.37 (mg/mL)⁻¹·cm⁻¹。做纯化的人都记得这个数字：1 cm 光程下 A280 = 1.37 的那管，浓度就是 1 mg/mL。
光穿过样品的距离。单位 cm。
光程:场景
10 mm(1 cm):标准石英比色皿，经典紫外仪的默认配置
5 mm(0.5 cm):样品量少时用的"半微量"比色皿
0.5 mm:板式紫外仪（如 Lunatic）单孔模式的固定光程
0.1 mm + 0.7 mm:Lunatic 双孔模式，仪器按样品浓度自动选哪一条
光程变短，同一浓度样品的 A 值也跟着变小。所以 Lunatic 这类板式仪能直接测 mg/mL 级别的抗体原液，dsDNA 能做到 13,750 ng/µL。传统 1 cm 比色皿通常只能测到百 µg/mL 级别。光程从 10 mm 缩到 0.1 mm，测量上限自然抬高两个数量级。Lunatic 报出的吸光度会自动换算成等效 10 mm 光程的标称值，所以和 1 cm 比色皿的读数可以直接比。
图 2 · 一束光穿过比色皿时，吸光度 A 由三件事共同决定：分子多少（c）、分子多能吸（ε）、光穿过多远（b）。底部 A = ε·c·b 用颜色对齐每个字母和物理量。
A = εcb 的线性关系有明确的适用前提：
Beer-Lambert 定律是稀溶液、单色光、理想条件下的一个好用近似。
1903 年，Max Planck 从色散理论证明：吸收很强时 Beer 定律不成立（见 Mayerhöfer 2020）。后来的理论把原因落到周围分子上：分子实际感受到的电场受邻近分子影响，浓度越高，影响越强。换句话说，A 与 c 的线性关系，只在浓度足够低时才成立。现实中遇到的偏离，主要来自三类原因：
稀溶液里，每个分子周围都是溶剂，相互之间距离远，独立吸收。浓度一高到毫摩尔量级以上（具体阈值因分子而异），分子要么形成二聚体、三聚体，要么仅仅是距离近到电子云开始重叠。这时吸收行为就不再和浓度严格成正比。
生物场景里这个问题最常见于高浓度抗体制剂（50–200 mg/mL）。直接测 A280，读数会低于理论值，原因是 Beer-Lambert 的线性关系在这个浓度下已经偏离。解决办法要么稀释，要么换到亚毫米级的短光程，要么换用可变光程的仪器。Lunatic 的 0.1 mm 光程就是为这种场景设计的。
理想情况下，仪器在某个波长发出的应该是单色光。现实中总有一小部分"错误波长"的光漏进来，被检测器当成信号，这就是"杂散光"(stray light)。
A 越高（样品吸收越强，真正透过的光越少），杂散光的相对影响就越大。
举一个数值例子。假设入射光强度记为 100 个单位，样品本该吸收 99%，只有 1 单位真正透过到检测器。
仪器里同时混入一小部分"错误波长"的光，强度相当于入射光的 0.5%，即 0.5 单位。样品对这个错误波长是透明的（它只吸收目标波长），这 0.5 单位的杂散光全部到了检测器。
检测器读到的总光 = 1 单位（真透过） + 0.5 单位（杂散） = 1.5 单位。仪器无法区分这两部分，把 1.5 / 100 = 1.5% 当作透过率去算 A:
A = −log₁₀(0.015) ≈ 1.82
比真值 A = 2.0 偏低将近 10%。
所以高 A 区的校准曲线会从直线向下弯，A 读不上去。
这就是为什么厂家给的工作范围普遍是 A = 0.1–1.5。A 大于 1.5 的区间线性度明显变差，测出来的数据不可靠。高端仪器通过杂散光抑制技术可以把可靠上限延伸到 A = 2 甚至 2.5，再高的读数就不建议直接使用了。
有些分子在溶液里会发生平衡反应：稀溶液以单体存在，浓溶液开始二聚、三聚甚至形成聚集体。每种形态的 ε 不一样。
核酸在稀溶液里有稳定的单链或双链结构，ε 比较可靠；但在高浓度或特定离子条件下可能形成聚集体，富 G 序列还能形成四链体等特殊二级结构。这些形态的 ε 和教科书表格里的值不一定一致。蛋白同理：可逆自聚集会让不同浓度下算出的 ε 有差异。
这类偏离的根源在样品本身的化学平衡，与仪器无关。要诊断它，靠 UV 一项看不出来，通常要结合粒径测量和色谱方法一起判断。
杂散光决定了 A 不能太高，下界则由信噪比决定。
A = 0.01 对应透过率 97.7%，样品只吸收了 2.3% 的光。若仪器噪声在 0.1% 量级，信号只比噪声大 20 多倍，相对误差已经不小。A 再低一些，信号就和噪声混在一起了。
所以实验室的经验法则：
吸光度:数据可信度
A < 0.05:信噪比太差，不推荐
A = 0.1–1.5:工作区，线性和信噪比均可接受
A > 1.5:需要考虑杂散光影响，最好稀释
A > 3:除非用特殊仪器，否则读数基本无意义
这组经验边界由物理和仪器共同决定：上限看杂散光，下限看信噪比。样品 A280 读到 2.5 时，先稀释；用的是可变光程的仪器，就让它自动切到更短光程。
A 的工作区只有 0.1–1.5，跨度 15 倍，但可测的浓度范围并不因此受限。
有两条路可以把它放大。
一条是换光程。公式里 A = ε · c · b，光程 b 本身就是一个可以调整的参数。同一浓度下，光程每缩短 10 倍，A 也跟着缩 10 倍。光程从 10 mm 缩到 0.1 mm，测量上限直接抬高 100 倍。Lunatic 的双光程板（0.7 mm + 0.1 mm，仪器按样品浓度自动切哪一条）走的就是这条路。同一块板一次测量，就能覆盖几个数量级的浓度范围，抗体原液不用稀释就能直接读。
另一条是从仪器工艺上推高可靠上限。前面说过，A = 1.5 这个上限主要是杂散光决定的。当一台仪器把杂散光控制得比常规更低，A-c 的线性区就能往 1.5 以上延伸，浓度上限也跟着抬高。
两条路合起来，可测浓度范围比 A 的 15 倍工作区宽两个数量级以上。
Bouguer P. Essai d'Optique sur la Gradation de la Lumière. Paris, 1729. · Lambert J. H. Photometria. Augsburg, 1760. · Beer A. Bestimmung der Absorption des rothen Lichts in farbigen Flüssigkeiten. Annalen der Physik 1852, 86, 78–88. · Mayerhöfer T. G., Pahlow S., Popp J. The Bouguer-Beer-Lambert Law: Shining Light on the Obscure. ChemPhysChem 2020, 21, 2029–2046. · Pace C. N. et al. How to Measure and Predict the Molar Absorption Coefficient of a Protein. Protein Sci. 1995, 4, 2411–2423. · Owen T. Fundamentals of Modern UV-Visible Spectroscopy. Agilent Technologies, 2000, Chapter 2.