NIST 标准品、Fundamentals 试剂盒、蛋白梯度稀释是三种独立的验证路径，覆盖从低吸光度参考物到 365 mg/mL 高浓度蛋白（v7.0 软件、100 cP 规格下测得）。在 Lunatic 上，NISTmAb 的测量值全部落在参考浓度的 1.25% 以内，Fundamentals 色氨酸梯度的线性 R² = 0.9999。
UV/Vis 分光光度计要先通过性能验证，定量结果才能被采信。验证通常耗时、耗样，而且目的不同，需要的参考材料也不同：确认仪器基线、考察高吸光度区间、检验真实蛋白基质，各有各的标准品。
在 Lunatic 上，耗时和耗样都压了下来：每个样品 2 µL，96 个样品 5 分钟读完，微流控通道固定光程、无蒸发。本文数据都来自 Lunatic；Stunner 的 UV/Vis 部分用同一套 Fundamentals 试剂盒和软件验证。
三种验证路径，各有侧重
- NIST 标准品 — 260 & 280 nm 认证值 — 独立、可溯源 — 波长和吸光度范围有限
- Fundamentals 试剂盒 — 280 nm 区间，5 个浓度 — 稳定、快速、软件自动分析 — 不含真实蛋白基质
- 蛋白梯度稀释 — 0.1–365 mg/mL 全范围 — 最接近真实样品场景 — 耗时、耗样
NIST 提供两种用于 UV/Vis 验证的标准物质。RM 8671（NISTmAb）是人源化 IgG1κ 单抗，浓度 10 mg/mL，来源独立、批间一致，适合用作治疗性蛋白定量方法的系统适用性测试。SRM 2082 包含色氨酸和尿嘧啶标准，分别对应蛋白（280 nm）和核酸（260 nm）的吸收特征，可用于计算微量 UV/Vis 仪器的实际光程。
按 USP 标准，药物浓度分析方法应落在已知浓度 ±2% 加上厂家不确定度（MU）的范围内。NISTmAb 的 MU 约为参考值的 0.4%，因此可接受范围约为 ±2.4%。
5 台 Lunatic × 8 次重复的结果
NISTmAb:全部 40 个测量值落在 10 mg/mL 参考浓度的 1.25% 以内，均值和中位数在 1% 以内
SRM 2082:色氨酸和尿嘧啶标准的换算光程均落在 10 mm 标称值的 2% 以内，均值和中位数在 1.25% 以内
NISTmAb 浓度按修正 Beer 定律计算：A280（空白校正后，10 mm 标称光程）除以理论消光系数 E1% = 14.2，再除以糖基质量修正因子 0.977。SRM 2082 则按证书公式，在 25 °C、1.75 nm 光谱带宽条件下将实测吸光度换算为光程。
NISTmAb 与 SRM 2082 中色氨酸、尿嘧啶两种标准的偏差百分比（% bias）。5 台 Lunatic，每组 8 次重复。虚线为 2% + 各自 MU。
NIST 标准确认了仪器基线，但覆盖的吸光度范围有限。Fundamentals 试剂盒用 5 个浓度的水溶性 L-色氨酸，专门考察蛋白定量最常用的 280 nm 区间。
为什么选色氨酸？蛋白在 280 nm 的吸收主要来自色氨酸残基，而水溶性 L-色氨酸在相同吸光度下比蛋白稳定得多。色氨酸的 E1% = 271.5，远高于人 IgG 的 13.7，所以试剂盒中的 1–8 mg/mL 色氨酸，对应的吸光度大致相当于 20–160 mg/mL IgG。换句话说，Fundamentals 考察的是仪器在高吸光度区间的表现，正好和 NIST 标准互补。
Lunatic & Stunner v7.0 软件引导完成 Fundamentals Check 的板位设置，自动保存目标浓度和 CRM 不确定度。
各浓度 16 次重复的吸收光谱叠加图（A）。实测浓度 vs. 目标浓度的线性回归，斜率 0.9945，R² = 0.9999（B）。16 个重复点多数情况下过于接近，无法分辨。
标准品 / 目标浓度 / 实测平均 / 回收率 / RSD
单位 mg/mL。平均浓度均在目标值 1% 以内，全部 RSD < 1%。
蛋白梯度稀释把验证放进真实的蛋白基质里，比任何标准品都更贴近实际样品。代价是更耗时、更耗样；在 Lunatic 上，每个样品只用 2 µL，96 孔一板就能跑完整组梯度。
两组蛋白梯度实验
HSA（人血清白蛋白）
0.85% NaCl 溶剂，重量法配制 7 个浓度（0.323–365 mg/mL），E1% = 5.37。最高两个浓度用 quick load + Protein (Turbidity) 应用测量。5 台 Lunatic × 8 次重复。
多克隆人 IgG
分别在 PBS（pH 7.4）和乙酸盐缓冲液（25 mM acetate, 100 mM NaCl, 0.025% Tween-80, pH 5.0）中配制 11 个浓度（0.1–200 mg/mL），E1% = 13.7。
这项测试在 v7.0 软件上完成。当时 v7.0 软件把最大可处理粘度从 40 cP 提升到 100 cP，并新增 quick load 模式，一次装载 16 个高粘度样品，所以 365 mg/mL 的 HSA 也能进入微流控通道。100 cP 只代表测试时的软件版本；按 UL 2026 年再版技术说明，现行规格以 40 cP 为准。
5 台 Lunatic 对 7 个 HSA 浓度的平均光谱叠加图（A，Y 轴对数坐标，280 nm 处虚线标出），及各浓度的仪器间 %CV 或 SD（B）。
*最低浓度以 SD（mg/mL）报告。其余浓度下，5 台仪器间的 %CV 为 0.23%–1.44%。
IgG 在 PBS 中的 11 点梯度稀释，实测浓度 vs. 目标浓度线性回归 R² = 0.9999，覆盖 0.1–200 mg/mL。换成乙酸盐缓冲液后，A280 vs. 目标浓度的 R² ≈ 1，所以缓冲体系从 PBS 换成乙酸盐，Lunatic 的线性没有变化。
PBS 中 11 个 IgG 梯度样品的实测浓度 vs. 目标浓度，0.1–200 mg/mL，R² = 0.9999。插图放大 0.1–20 mg/mL 区间。
乙酸盐缓冲液中 11 个 IgG 梯度样品的 A280 vs. 目标浓度，0.1–200 mg/mL，R² ≈ 1。插图放大 0.1–20 mg/mL 区间。
三套数据彼此独立，分工也不同：NIST 标准品给出可溯源的仪器基线，Fundamentals 试剂盒考察 280 nm 的高吸光度区间，蛋白梯度稀释检验真实基质下的线性。三套结果都在接受范围内，所以选哪条路径，只取决于这次验证要回答什么问题。
具体来说，需要独立溯源时用 NIST 标准品；需要快速复查 280 nm 区间时用 Fundamentals 试剂盒；要确认自己的蛋白和缓冲体系时，做蛋白梯度稀释。