建一个 Lunatic 实验:板布局和 blank 怎么设才不出错

建一个 Lunatic 实验:板布局和 blank 怎么设才不出错

从打开软件到按下 Start,建一个 Lunatic 实验要依次设应用、板类型、板布局、blank 和样品信息。其中板布局和 blanking 这两步容易出错,一旦选错 blank 类型或者分组没分好,浓度结果就会整体偏移。

Client 和 Analysis 分别管什么

Lunatic 配套两个独立程序。Lunatic & Stunner Client 装在连仪器的电脑上,用来建实验、跑测量;Lunatic & Stunner Analysis 用来看数据、出报告,可以装在另一台电脑上,方便在办公桌前做分析。

日常操作中,在 Client 里按下 Start,测量跑完后 Analysis 会自动弹出,直接打开结果页面。

Options 菜单里还有一些全局管理功能:

Client 主界面。四大类应用(Protein、Nucleic Acids、Other、Homebrew)点击对应图标即可开始建实验。右上角的仪器连接状态和用户账户也在这里。

选对 Application

在主界面点击样品大类(比如 Protein),进入 Select Application 界面。这个大类下已安装的 application 再按五个标签页分类,下面以 Protein 为例:

选中后底部会显示简短说明和版本号,确认是你要用的应用再点 Next。

Select Application 界面。选中 Protein (Turbidity) 后,底部显示应用说明。这个应用用 A280 和用户自定义 E1% 消光系数算蛋白浓度,同时扣除浊度背景。

实验命名和板类型

Experiment Info 界面填两件事:

Unmix 类应用选不了 Standard 96-well plate。Unmix 的光谱解卷积依赖 Lunatic Plate 的精确光程和比色皿结构,普通孔板达不到这个精度。

板布局:标出 Blank、Sample 和 Reference

Plate Layout 界面是一张 96 孔网格图。每个孔位要标成 Blank、Sample 或 Reference:

BBlank — 背景参考。软件拿 blank 的光谱做背景扣除(blanking)。建议每个实验至少放一个 blank 孔位,多个 blank 会自动取平均。如果你用了 stored blanks,也可以不放,后面会有一步让你选

SSample — 待测样品。在网格上点选或拖选

RReference — 只在 Standard Curve 模式下用。放已知浓度的参考品来建标准曲线

左侧选类型,右侧在网格上画:点击单个孔位或者拖选一片区域。标错了切到 Erase 模式擦掉重来。

需要测多板的实验,点界面上方的「+」加板。Blank 只需要在第一块板上设置,会自动应用到后续所有板。多板实验中用 barcode 验板可以打乱装板顺序,仪器会自动识别。

Plate Layout 界面。左侧选类型,右侧在网格上点选孔位。支持 Excel 模板导入导出,重复做同类实验时不必逐孔重填。

Blanking 策略:Classic 和 Unmix 的 blank 不同

Blank 孔位里放什么溶液,直接决定浓度算得准不准。Classic 和 Unmix 的要求完全不同:

应用类型 / Blank 用什么 / 为什么

Classic UV/Vis:Blank 用什么 样品的洗脱缓冲液;为什么 扣除缓冲液本身的紫外吸收背景

Unmix:Blank 用什么 必须用水;为什么 Unmix 算法已内置缓冲液光谱模型。再用缓冲液做 blank 会导致"过度扣除"(overblanking),会引入误差、让残差升高,结果不可靠

如果板布局里没有指定任何 blank 孔位,软件不会报错。它会在 Sample Groups 步骤之后弹出一个 Blanks 界面。你可以在这里选择要不要用之前存储的 stored blanks,或者干脆不做 blanking。

Stored Blanks:测一次,用 100 天

以前实验里测过的 blank 可以存下来反复用,不用每次都专门加 blank 孔位。存储要求:同一台仪器、同一种板类型、至少 3 个重复性合格的 blank。有效期 100 天,如果中间做了仪器校准则提前失效。过期的 stored blanks 不会自动删除(回溯分析可能还要用到),但新实验里不能再选。

Sample Groups:什么时候要分组

假设你同一块板上测两批蛋白,一批用 PBS 洗脱,一批用 Tris 洗脱。PBS 和 Tris 的紫外吸收不一样。如果所有样品都用同一个 blank 扣背景,其中一批的浓度就会有系统性偏差。

Sample Group 把用同一种缓冲液的样品和对应的 blank 编到一组。这样每组都用自己的 blank 扣背景。一个实验最多 12 组。大多数情况下一组就够了,只要所有样品都在同一种缓冲液里。

Sample Groups 界面。这个例子中建了 3 个 Sample Group,每组用不同颜色标记。左侧选组,右侧在网格上指定属于该组的孔位。

Edit Samples:命名和参数

这一步给每个孔位填详细信息。具体能填哪些字段取决于你选的 application。蛋白定量类的可以逐孔设置 E1% 消光系数和 Analyte(蛋白类型)、Buffer 类型。Classic UV/Vis 还能指定最多 3 个 wavelengths of interest(关注波长)。结果表格里会额外显示这些波长上的 OD 值。

命名时注意:名字一样的孔位会自动当做 replicate,结果里合并做统计(平均值、RSD)。重复孔用同一个名字,不同样品一定要区分开。

96 个孔逐个手填费时,可以用 Excel 模板批量导入。在 Plate Layout 界面点导出按钮,软件会生成一份模板。模板每行是一个孔位,列包括:

在 Excel 里批量填好再导入,一块板的设置一次导入。每天跑同一类实验的话,Excel 模板改改日期和样品名就能反复用。

Edit Samples 界面。每行对应一个孔位,可以编辑 Sample name、Analyte、E1%、Buffer 等属性。同名样品自动按 replicate 处理。

确认、装板、开始

前面的步骤都走完后,Overview 界面汇总这次实验的关键参数,核对下面几项无误后点 Next:

Overview 界面。开始测量前的最后一次检查:核对应用、板类型和样品数是否正确。

仪器托盘会自动弹出,进入 Load Plate 界面。按照屏幕上的网格布局指示装载板(A1 在右上角),选择板 ID 验证方式:

Load Plate 界面。绿色孔位是本次要测的位置。底部可以选择 User 或 Barcode 验证方式。

点击 Start,托盘关闭,测量开始。96 个样品在 Lunatic Plate 上大约 5 分钟跑完,在 High Lunatic Plate 上约 10 分钟。

### 测量过程中可以 Abort 吗?

可以。Abort 之后,当前这块板的数据不会保存。但如果是多板实验,前面已经测完的板数据会正常保留,后续的板也会继续测。

测量完成后,Lunatic & Stunner Analysis 会自动启动并打开实验结果。接下来的数据怎么看,请参考 Classic UV/Vis 结果解读 和 Unmix 结果解读 。