蛋白浓度够不够、有没有聚集?2 µL 同时回答两个问题

蛋白浓度够不够、有没有聚集?2 µL 同时回答两个问题

Stunner 的 Sizing & Polydispersity 应用在同一个 2 µL 样品上同时跑 UV/Vis 定量和 DLS 粒径分析:浓度通过 A280 + 瑞利散射校正计算,粒径和 PDI 通过 DLS 测量。96 个样品不到 1 小时,不用稀释,不用标准曲线。在做完整的生物物理表征之前先跑一遍,浓度不对或已经聚集的样品可以提前筛出来。

Sizing & Polydispersity 应用:空白配对、Analyte 参数和报告项

在 Stunner Client 软件主界面选择 Protein UV/Vis & DLS,再选 Sizing & Polydispersity 应用。DLS 的采集次数和采集时间可以自定义。同一块板上可以设置多个空白位,通过样品组(Sample Group)把每组样品和对应的空白配对。每种蛋白作为 Analyte 输入,包括 E1%、分子量和折射率增量;缓冲液参数(折射率和粘度)也一并设置。

在 Stunner Client 软件中选择 Sizing & Polydispersity 应用。

UV/Vis 和 DLS 同时测量后,Stunner 报告以下几项:

还有两种粒径分布图:强度分布(绿色,各粒径的相对散射贡献)和质量分布(蓝色,各粒径的相对质量占比)。强度分布对大颗粒/聚集体更敏感,质量分布更能反映样品的实际组成。

软件界面

Overview 界面同屏显示整板 96 个样品的吸收光谱、强度分布和质量分布,可以快速定位浓度异常或聚集样品。点击单个样品进入 Details 界面,查看完整的 UV/Vis 光谱和 DLS 曲线,Z-Average、PDI 和 Peak 1 均径都在底部结果表里。报告支持 HTML、XML、TXT、XLSX、PDF 和 CSV 格式导出,内容可自定义。

Stunner Client 的 Home 界面与 Select application 窗口:先选应用类型(PROTEIN UV/VIS & DLS 等),再进入测量。

Overview 界面:同屏显示整板的吸收光谱、强度分布和质量分布,快速对比各样品的浓度和粒径。

9 种蛋白实测:同一次测量得到浓度、粒径和 PDI

9 种分子量从 5.8 kDa(胰岛素)到 660 kDa(甲状腺球蛋白)的蛋白,冻干粉复溶到 PBS(pH 7.4)中,目标浓度 5 或 10 mg/mL。每种蛋白 2 µL × 8 次重复,DLS 4 采集 × 5 秒。不到 1 小时全部测完。

各蛋白的实测浓度列在下表,偏离目标最多的是 aldolase(4.61)。粒径这边,Insulin 和 BSA 的 PDI 低于 0.1,样品高度单分散。IgG、thyroglobulin、lysozyme 和 ovalbumin 的 PDI 在 0.1–0.2 之间,属于中等分散。Conalbumin(0.22)、aldolase(0.25)和 RNase A(0.33)的 PDI 超过 0.2,可能存在聚集体。聚集体的量不一定大:RNase A 的聚集体按质量只占约 0.5%(见后文 BSA 与 RNase A 的对比)。由于强度分布中可能有多个峰,Peak 1 均径报告的是单体的粒径。

蛋白 / E1% / MW (kDa) / 浓度 (mg/mL) / Peak 1 均径 (nm) / PDI

8 次重复的平均值。PDI > 0.2 以 amber 高亮,可能存在聚集体。

Details 界面:单个样品的完整 UV/Vis 光谱和 DLS 曲线,底部报告浓度、Z-Average、PDI 和 Peak 1 均径。

BSA vs RNase A:单分散和聚集样品的区别

BSA(PDI 0.07)和 RNase A(PDI 0.33)是这批样品中两个极端。BSA 的强度分布只有一个尖锐的单峰,质量分布也是单峰,说明样品高度均一。RNase A 的强度分布出现多个峰,PDI 很高,说明有聚集体存在。

RNase A 强度分布中两个峰的相对强度为 33.4% 和 66.6%。但从质量分布来看,样品的绝大部分质量仍然是单体,聚集体只占约 0.5%。强度分布对聚集体格外敏感(散射与粒径的 6 次方成正比),即使质量占比很小,在强度分布中也会形成显眼的峰。

BSA(A)和 RNase A(B)的强度分布(绿色)和质量分布(蓝色插图)。BSA 单峰、低 PDI = 单分散。RNase A 多峰、高 PDI = 有聚集体,但质量分布显示聚集体只占 ~0.5%。

快速排查:浓度对不对、有没有聚集

RNase A 的例子说明,PDI 高只是信号,聚集体占多少要回到质量分布里看。所以这个应用适合放在完整表征之前做预检:浓度正常但 PDI 偏高的样品先标出来,再按聚集体的质量占比决定是否重新纯化。