用泛四跨膜蛋白 Luni 检测外泌体：三种检测模式的流程

用泛四跨膜蛋白 Luni 检测外泌体：三种检测模式的流程

泛四跨膜蛋白（Pan-Tetraspanin）捕获抗体抓住外泌体后，按要读的信息在三种检测模式里选择：只测粒径和计数，走 Section 2；加表面标记荧光染色，走 Section 3；货物和表面标记一起染，走 Section 4。样品孵育（Section 1）和 Luni 干燥（Section 5）各模式共用。如需检测慢病毒样品中的 EV 污染，请参考《慢病毒 EV 污染物检测实验流程》。

试剂盒内容与存储

Leprechaun Kit 组件

组件 / 数量 / 4–8 °C / 室温

Lunis:数量 8;4–8 °C ✓

Incubation Solution (10X):数量 5 mL;4–8 °C ✓

Blocking Solution:数量 10 mL;4–8 °C ✓

Solution A (10X):数量 25 mL;4–8 °C ✓

Solution B (10X):数量 30 mL;4–8 °C ✓

USB flash drive with Luni files:数量 1;室温 ✓

Adhesive plate seals:数量 2;室温 ✓

可选荧光抗体（单独销售）

名称 / 货号 / 体积 / 4–8 °C

Pan-Tetraspanin Fluorescent Antibody (RGB):货号 251-1065;体积 25 µL;4–8 °C ✓

Pan-Tetraspanin Fluorescent Antibody (Blue):货号 251-1063;体积 25 µL;4–8 °C ✓

Luni Washer 组件（单独销售）

名称 / 货号 / 数量 / 4–8 °C / 室温

Solution A (10X):货号 251-1053;数量 100 mL;4–8 °C ✓

Solution B (10X):货号 251-1054;数量 100 mL;4–8 °C ✓

Luni Washer 24 Well Plate:货号 251-1055;数量 10;室温 ✓

使用前需将所有溶液恢复至室温。

额外所需设备

• —去离子水（推荐 Fisher Scientific Catalog# LC267404）或电阻率 18.2 MΩ·cm 的超纯水
• —EMS 风格碳纤维尖头细尖镊子（推荐 Fisher Scientific Catalog# 50-193-0842）

样品与试剂准备

样品准备

细胞培养基样品：Leprechaun 可直接分析细胞培养上清，包括使用外泌体去除胎牛血清补充的培养基。孵育前建议离心两次（2500 × g，15 分钟）去除细胞碎片。

纯化样品：Leprechaun 不兼容 PEG 纯化的样品。纯化样品无需孵育前离心。

生物体液样品：Leprechaun Exosome Kits 可检测血浆、血清、脑脊液（CSF）、尿液和唾液中的 EV。生物体液的采集和储存条件会影响背景水平，所以要先看同型对照。如果同型对照上的颗粒数超过 500，建议用尺寸排阻色谱（SEC）纯化样品（见附录 II）。

外泌体标准品（仅 Exosome Starter Kit 提供）：将冻干标准品重悬于 100 µL 1X Incubation Solution；16 小时孵育时稀释 1:50，再加载到 Luni 上。

使用新样品时必须确定正确的稀释度，推荐稀释见附录 III。

试剂配制

Solution A 和 B：将单独购买的 100 mL（10X）与 900 mL 去离子水混合；试剂盒自带的 25 mL 和 30 mL 按同一比例稀释。稀释后装入对应标有 Solution A 或 B 的清洁 Luni Washer 瓶中。1X 溶液可在 Washer 瓶中室温保存，最多一个月，之后随每月 Washer 清洁更换。

Incubation Solution：将 5 mL Incubation Solution（10X）与 45 mL 去离子水混合在 50 mL 锥形管中。1X Incubation Solution 应储存在 4 °C。

可选荧光抗体混合物：推荐终浓度 0.01–2.5 µg/mL（在 Blocking Solution 中）。使用试剂盒外抗体时，需自行确定最佳浓度（见附录 IV）。不要使用二抗。确认新抗体偶联的荧光素与 Leprechaun 兼容（参考《Leprechaun 荧光通道技术规格》）。

Luni 操作

避免触碰 Luni 中心区域。始终使用随附的镊子夹取边缘。

左：正确，镊子夹取边缘；右：错误，触碰中心区域

Section 1：样品孵育

Luni 必须在开始前完成背景扫描。

本试剂盒仅兼容 Leprechaun Client & Analysis Software v2.1 或更高版本。

如不使用荧光抗体，请确认 Luni Washer 上存在 PANTETRASPANIN 程序。如不存在请联系 support@unchainedlabs.com。

• 1.1 从冰箱取出装有 Luni 板的 Mylar 袋，等待 15 分钟回温至室温后再打开。
• 1.2 将 Luni Washer 24 Well Plate 放在无振动的实验台上。
• 1.3 使用镊子将 Luni 放入孔的中心，确保正确操作： - —每孔仅放一个 Luni - —Luni ID 朝向干燥斜台（ramp） - —装载多个 Luni 时，按行填充而非按列
• 1.4 用 1X Incubation Solution 将样品稀释至所需浓度，至少稀释 1:1；该溶液使用前先回温至室温。推荐稀释见附录 III。
• 1.5 移取 50 µL 稀释样品到 Luni 上。不要用枪头触碰 Luni，避免产生气泡。
• 1.6 用粘附板封口膜密封板子，确保气密。室温孵育 16 小时（过夜），放在无振动的实验台上。EV 群体丰富时，孵育时间可缩短至 1 小时。
• 1.7 只测 EV 粒径和计数、不做荧光染色 → 继续 Section 2。
• 1.8 除粒径和计数外，还要用荧光标记检测表面或货物标记 → 继续 Section 3 或 4。

Section 2：EV 粒径与计数

使用前让所有溶液恢复至室温。

• 2.1 孵育完成后，揭开封口膜，将板放入 Luni Washer。放板时 A1 孔朝左上、板放平，干燥斜台在孔的远端边缘，再合上盖子。
• 2.2 在触摸屏上选择 PANTETRASPANIN。
• 2.3 按 First Strip，输入第一行编号。
• 2.4 按 Number of Strips，输入总行数。
• 2.5 按 Start。
• 2.6 提示时将 Luni 移至干燥斜台，继续 Section 5。

Section 3：表面标记免疫荧光染色

使用前让所有溶液恢复至室温。

• 3.1 孵育完成后，揭开封口膜，将板放入 Luni Washer。放板时 A1 孔朝左上、板放平，干燥斜台在孔的远端边缘，再合上盖子。
• 3.2 在触摸屏上选择 Exosome。
• 3.3 按 First Strip，输入第一行编号。
• 3.4 按 Number of Strips，输入总行数。
• 3.5 按 Start。
• 3.6 配制荧光抗体混合物：每个 Luni 加 300 µL Blocking Solution 到低吸附管中。
• 3.7 向 Blocking Solution 中加入抗体，两种方案任选其一： 方案 A：RGB 三色分通道 - —0.6 µL (1:500) anti-CD9 (CF® 488A) - —0.6 µL (1:500) anti-CD81 (CF® 555) - —0.6 µL (1:500) anti-CD63 (CF® 647) 方案 B：Blue 单通道检测三种四跨膜蛋白 - —0.6 µL (1:500) anti-pan tetraspanin (CF® 488A) 可用自选抗体替换。
• 3.8 涡旋 5 秒。
• 3.9 提示时向每孔加入 250 µL 荧光抗体混合物。染色 60 分钟，Washer 自动清洗并置换为水。
• 3.10 合上盖子，按 Continue。
• 3.11 提示时将 Luni 移至干燥斜台，继续 Section 5。

Section 4：货物和表面标记免疫荧光染色

使用前让所有溶液恢复至室温。

• 4.1 孵育完成后，揭开封口膜，将板放入 Luni Washer。放板时 A1 孔朝左上、板放平，干燥斜台在孔的远端边缘，再合上盖子。
• 4.2 在触摸屏上选择 Exosome Cargo。
• 4.3 按 First Strip，输入第一行编号。
• 4.4 按 Number of Strips，输入总行数。
• 4.5 按 Start。
• 4.6 提示时向每孔加入 250 µL Solution C。
• 4.7 合上盖子，按 Continue。
• 4.8 提示时向每孔加入 250 µL Solution D。
• 4.9 合上盖子，按 Continue。
• 4.10 配制荧光抗体混合物：每个 Luni 加 300 µL Blocking Solution。
• 4.11 向 Blocking Solution 中加入抗体，两种方案任选其一： 方案 A：三色分通道 - —0.6 µL (1:500) anti-CD9 (CF® 488A) - —1.5 µL (1:200) anti-syntenin (CF® 555) - —0.6 µL (1:500) anti-CD63 (CF® 647) 方案 B：蓝色通道四跨膜蛋白 + 绿色通道 syntenin - —0.6 µL (1:500) anti-pan tetraspanin (CF® 488A) - —1.5 µL (1:200) anti-syntenin (CF® 555) 可用自选抗体替换。
• 4.12 涡旋 5 秒。
• 4.13 提示时向每孔加入 250 µL 荧光抗体混合物。染色 60 分钟，Washer 自动清洗并置换为水。
• 4.14 合上盖子按 Continue。提示时将 Luni 移至干燥斜台，继续 Section 5。

Section 5：Luni 干燥

• 5.1 将 Luni 移至干燥斜台，确保移动过程中始终浸没。按 Continue。
• 5.2 程序完成后，取出 Luni 放在吸水垫上，Luni ID 朝上。完全干燥后方可扫描。
• 5.3 装入 Luni Holder，在 Leprechaun 上扫描。

如不能立即扫描，将 Luni 在 4 °C 存放于 Mylar 袋中。使用前等待 15 分钟回温再打开。

附录

附录 I：从全血中分离人血浆

所需材料：含抗凝剂的采血管、移液器、15 mL 管、冻存管、温控离心机（摇摆转子）。

开始前：使用 4–12 mL 新鲜血液，不使用冻存血液。离心机预设 19 °C，加速/减速中速。

• A1-1. 在 19 °C 下以 1300 × g 离心 15 分钟，离心后分为三层：血浆、白细胞、红细胞。
• A1-2. 收集血浆转移至新管，避免吸入其他层。
• A1-3. 将新管中的血浆在 19 °C 下以 5000 × g 离心 20 分钟。
• A1-4. 分装到冻存管，−80 °C 保存。

附录 II：使用 SEC 纯化血浆 EV

所需材料：IZON qEV Single（70 nm 或 35 nm）、移液器、附录 I 血浆、1.5 mL 收集管、1X Solution B。

开始前：用 3 mL 1X Solution B 预平衡柱子 3 次。

• A2-1. 加 150 µL 血浆到柱子上。
• A2-2. 加 850 µL 1X Solution B，弃去馏分 1–5。
• A2-3. 加 200 µL，收集馏分 6（第一个 EV 馏分）。
• A2-4. 加 200 µL，收集馏分 7。
• A2-5. 加 200 µL，收集馏分 8。
• A2-6. 取 50 µL 各馏分或合并 6–8 后取 50 µL 孵育于 Luni。

附录 III：样品稀释推荐

使用新样品时需优化稀释倍数。在 Leprechaun Analysis 中查看数据时，任何通道（粒径或荧光）的颗粒计数应低于 5000 以确保在可量化范围内。

下表按样品类型列出初始稀释推荐：

样品类型 / 推荐稀释 / 说明

细胞培养上清（未纯化）:推荐稀释 1:2;说明 孵育前离心两次 2500 × g，15 分钟。大多数细胞能产生足够的 EV 供检测，推荐使用未纯化样品以避免纯化引入偏差。细胞至少 50% 汇合度以确保足够 EV 浓度

纯化 EV:推荐稀释 梯度稀释 1:10, 1:100, 1:1000;说明 不同纯化技术产出的 EV 浓度差异大，输入颗粒数取决于具体方法和样品来源

尿液:推荐稀释 1:3;说明 孵育前离心两次 2500 × g，15 分钟。尿液通常不干扰 Leprechaun 分析。如同型对照有背景，用 SEC（附录 II）纯化样品

脑脊液（CSF）:推荐稀释 1:10;说明 孵育前离心两次 2500 × g，15 分钟。CSF 通常不干扰 Leprechaun 分析。如同型对照有背景，用 SEC（附录 II）纯化样品

血浆 / 血清:推荐稀释 按附录 I 和 II;说明 血浆含有干扰 Luni 的成分。SEC 可分离大部分污染物。Unchained Labs 推荐使用附录 I 的方案从全血纯化血浆

附录 IV：免疫荧光标记优化

不同来源的 EV 差异大，免疫荧光染色应针对每种检测单独优化。使用自定义抗体或样品时，颗粒计数应低于饱和值。对于某些样品或抗体，可能需要优化 Blocking Solution。

A4-1. 用单染测试自选抗体，终浓度取 0.01–2.5 µg/mL。能产生最大颗粒数的最低浓度，就是最佳浓度。

Figure A4.1：单染条件下三种荧光抗体的滴定曲线

A4-2. 比较单染与混染结果。如混染计数下降，重新优化或改用顺序染色。

Figure A4.2:(a) 混染计数与单染一致，可用混合抗体；(b) 混染导致计数下降，需重新优化或顺序染色

A4-3. 顺序染色：先加混染中计数下降最多的抗体，依次加入其余。步骤更多，但可兼容所有抗体。

附录 V：抗体信息

捕获抗体

靶标 / 克隆 / 描述 / 交叉反应

Human CD9:克隆 HI9a;描述 Mouse, IgG1,κ;交叉反应 Bovine

Human CD81:克隆 JS-81;描述 Mouse, IgG1,κ

Human CD63:克隆 H5C6;描述 Mouse, IgG1,κ

Human CD41a:克隆 HIP8;描述 Mouse, IgG1,κ

Isotype control:克隆 MOPC-21;描述 Mouse, IgG1,κ

Mouse CD81:克隆 Eat-2;描述 Armenian Hamster IgG;交叉反应 Rat

Mouse CD9:克隆 MZ3;描述 Rat IgG2a, κ

Isotype control:克隆 HTK888;描述 Armenian Hamster IgG

Isotype control:克隆 RTK2758;描述 Rat IgG2a, κ

检测抗体

靶标 / 克隆 / 描述 / 交叉反应

Human CD9:克隆 HI9a;描述 Mouse, IgG1,κ;交叉反应 Bovine

Human CD81:克隆 JS-81;描述 Mouse, IgG1,κ

Human CD63:克隆 H5C6;描述 Mouse, IgG1,κ

Mouse CD81:克隆 Eat-2;描述 Armenian Hamster IgG;交叉反应 Rat

Mouse CD9:克隆 MZ3;描述 Rat IgG2a, κ

Mouse CD63:克隆 NVG-2;描述 Rat IgG2a, κ

Human Syntenin:克隆 EPR8102;描述 Rabbit IgG

• sample-prep · 样品与试剂准备
• section-2 · EV 粒径与计数