慢病毒 RNA 基因组检测实验流程

慢病毒 RNA 基因组检测实验流程

Leprechaun Lentivirus VSVG RNA Kit 和 Flex RNA Kit 用 SYTO14 RNA 染料标记慢病毒基因组。染料要与样品过夜孵育，所以流程分两天：Day 1 做样品–RNA 染料孵育，Day 2 把样品加到 Luni 上并完成免疫荧光染色。

试剂盒内容与存储

Leprechaun Kit 组件

组件 / 数量 / −20 °C / 4–8 °C / 室温

Lunis:数量 8;4–8 °C ✓

Fluorescently labeled anti-p24:数量 25 µL;4–8 °C ✓

SYTO14 RNA dye:数量 25 µL;−20 °C ✓

Incubation Solution (10X):数量 5 mL;4–8 °C ✓

Solution C:数量 5 mL;4–8 °C ✓

Solution D:数量 5 mL;4–8 °C ✓

Blocking Solution:数量 10 mL;4–8 °C ✓

USB flash drive with Luni files:数量 1;室温 ✓

Adhesive plate seals:数量 2;室温 ✓

使用前需将所有溶液恢复至室温。

Luni Washer 组件（单独销售）

Solution A (10X) / 100 mL / 4–8 °C

Solution B (10X):100 mL 100 mL;4–8 °C 4–8 °C

Luni Washer 24 Well Plates:100 mL 10;4–8 °C 室温

额外所需设备

• —去离子水（推荐 Fisher Scientific Catalog# LC267404）或电阻率 18.2 MΩ·cm 的超纯水
• —EMS 风格碳纤维尖头细尖镊子（推荐 Fisher Scientific Catalog# 50-193-0842）
• —FBS

样品与试剂准备

样品准备

细胞收获样品：Leprechaun 可直接分析细胞收获样品。孵育前建议离心两次（2500 × g，15 分钟）去除细胞碎片。

纯化样品：纯化样品无需孵育前离心。

EV 标准品（仅 Lentivirus Starter Kit 提供）：将冻干标准品重悬于 100 µL 1X Incubation Solution，稀释 1:50 后加载到 Luni 上。

试剂配制

Solution A 和 B：将 100 mL（10X）与 900 mL 去离子水混合。混合液装入标有对应 Solution A 或 B 的清洁 Luni Washer 瓶中。1X 溶液可在 Washer 瓶中室温保存，最多一个月，之后随每月 Washer 清洁更换。

Incubation Solution：将 5 mL Incubation Solution（10X）与 45 mL 去离子水混合在 50 mL 锥形管中。1X Incubation Solution 应储存在 4 °C。

Luni 操作

避免触碰 Luni 中心区域，以免损坏表面抗体。始终使用随附的镊子夹取 Luni 边缘。

左：正确，镊子夹取边缘；右：错误，触碰中心区域

Section 1：样品–RNA 染料孵育（Day 1）

Solution 1（含 1% FBS 的 Incubation Solution）和 Solution 2（10 µM 染料溶液）必须每天现配现用。

RNA 染料使用前必须回温至室温。未使用的染料可存回冻箱，保持原包装。

• 1.1 配制 Solution 1：向 1X Incubation Solution 中加入足量 FBS，使终浓度为 1% FBS（即 Incubation Solution w/ 1% FBS）。
• 1.2 配制 Solution 2（10 µM 染料溶液）：在干净的管中，取 1 µL RNA 染料加入 499 µL 新鲜的 1X Incubation Solution。
• 1.3 将样品、Solution 1 和 Solution 2 混合，使样品稀释至所需浓度，且染料溶液最终稀释 1:10。 示例：1:20 样品稀释 2.5 µL 样品 + 5 µL 10 µM 染料溶液 + 42.5 µL 含 1% FBS 的 Incubation Solution 样品至少需稀释 1:1，最终总体积不少于 50 µL。最佳稀释倍数见附录 II。
• 1.4 将样品-染料混合物在 37 °C 过夜孵育（16 小时）。孵育期间避光保护。

Section 2：样品–Luni 孵育（Day 2）

如使用 Flex 版本的 RNA Kit，Luni 必须在样品孵育前完成功能化。请参考 Leprechaun Flex Conjugation Protocol。

Luni 必须在开始此程序前完成背景扫描。

在步骤 2.4 中将样品-染料混合物加到 Luni 之前，确保其已回温至室温。

• 2.1 从冰箱取出装有 Luni 的 Mylar 袋，等待 15 分钟回温至室温后再打开。
• 2.2 将 Luni Washer 24 Well Plate 放在无振动的实验台上。
• 2.3 使用镊子将 Luni 放入孔的中心，确保正确操作： - —每孔仅放一个 Luni - —Luni ID 朝向干燥斜台（ramp） - —装载多个 Luni 时，按行填充而非按列
• 2.4 移取 50 µL 样品-染料混合物到 Luni 上。不要用枪头触碰 Luni，避免产生气泡。
• 2.5 用粘附板封口膜密封板子，确保气密。室温孵育 1 小时，放在无振动的位置。孵育期间避光保护。

Section 3：免疫荧光染色

使用前让所有溶液恢复至室温。

• 3.1 孵育完成后，揭开封口膜，将板放入 Luni Washer。放板时 A1 孔朝左上、板放平，再合上盖子。
• 3.2 在 Luni Washer 触摸屏主菜单上选择 Lentivirus。
• 3.3 按 First Strip，输入含有 Luni 的第一行编号。
• 3.4 按 Number of Strips，输入含有 Luni 的总行数。
• 3.5 按 Start。
• 3.6 提示时打开盖子，向每个孔中加入 250 µL Solution C。
• 3.7 合上盖子，按 Continue。
• 3.8 提示时打开盖子，向每个孔中加入 150 µL Solution D。 > Solution D 必须直接移入孔底，不要沿孔壁加入。 > > 首次分析新慢病毒样品时，建议滴定 Solution D 用量以确保最大衣壳检测率。详见附录 III。
• 3.9 合上盖子，按 Continue。
• 3.10 配制荧光抗体混合物：向低吸附管中为每个 Luni 加入 300 µL Blocking Solution。
• 3.11 向 Blocking Solution 中加入： - —1.2 µL (1:250) anti-p24 (CF® 647)
• 3.12 涡旋荧光抗体混合物 5 秒。
• 3.13 提示时打开盖子，向每个孔中加入 250 µL 荧光抗体混合物，染色 1 小时。染色完成后，Washer 自动清洗 Luni 并置换为水。
• 3.14 合上盖子，按 Continue。

Section 4：Luni 干燥

• 4.1 提示时将 Luni 移至干燥斜台。确保 Luni 在移动过程中始终浸没在液面下。按 Continue。
• 4.2 程序完成后，取出 Luni 放在吸水垫上，Luni ID 朝上。完全干燥后方可扫描。
• 4.3 将 Luni 装入 Luni Holder，在 Leprechaun 上扫描。

如不能立即扫描，将 Luni 在 4 °C 存放于 Mylar 袋中。使用前等待 15 分钟回温至室温再打开袋子。

附录

附录 I：Leprechaun Lentivirus RNA Kits 抗体信息

捕获抗体

靶标 / 克隆 / 描述

VSVG:克隆 8G5;描述 Mouse, IgG2a

p24:克隆 39/5.4a;描述 Mouse, IgG1,κ

VSVG Isotype control:描述 Mouse, IgG2a

p24 Isotype control:克隆 MOPC-21;描述 Mouse, IgG1,κ

检测抗体

靶标 / 克隆 / 描述

p24:克隆 39/6.14;描述 Mouse, IgG1,κ

附录 II：优化样品稀释

初始筛选时，慢病毒样品应稀释至 1.5×10⁸ vp/mL。高浓度样品可能需要进一步稀释。

FBS 加入 Incubation Solution 中是为了在过夜孵育期间稳定样品并减少病毒降解。即便如此，不同样品经过一夜的稳定性仍有差别，所以 RNA 检测可能需要比 EV Contaminant Kit 检测更高的样品浓度，才能得到最佳结果。

附录 III：优化衣壳检测

首次分析慢病毒样品时，建议滴定步骤 3.8 中 Solution D 的用量，以确保最大衣壳检测率。Solution D 可在 150 µL 至 400 µL 范围内调整，无需更新 Luni Washer 预设程序。

使用同一样品以递增的 Solution D 体积分析，直到 % LV w/ capsid 达到最大值。

RNA 检测中 % LV w/ capsid 的计算公式：

% LV w/ capsid =

LV w/ capsid & RNA + LV w/ capsid w/o RNA

LV w/ capsid & RNA + LV w/ capsid w/o RNA + LV w/o capsid w/ RNA + LV w/o capsid w/o RNA

× 100

来自同一细胞系、经过相似纯化流程并储存在相同缓冲液中的样品，应使用相同体积的 Solution D。慢病毒基因组载荷的变化不影响通透性，所以只换载荷时不必重新滴定 Solution D。

初始优化完成后，无需再调整 Solution D 用量，慢病毒生产工艺或储存缓冲液发生重大变化时除外。

• sample-prep · 样品与试剂准备
• section-1 · 样品–RNA 染料孵育（Day 1）
• section-2 · 样品–Luni 孵育（Day 2）