Leprechaun Flex 抗体功能化实验流程

Flex Luni 要先用自定义抗体功能化，才能做背景扫描和样品孵育。抗体经缓冲液交换和浓缩后与 Flex Linker 偶联，淬灭后不需要纯化，稀释 1:100 加到 Luni 上孵育 30 分钟即可。这套流程适用于 Lentivirus Flex RNA Kit、Lentivirus Flex EV Contaminant Kit、Exosome Human Tetraspanin Flex Kit、Exosome Human Plasma Flex Kit，以及可分析任何样品类型的 Leprechaun Flex Kit。Flex Conjugation Kit 冷链运输，收到后请把偶联试剂存放在 −20 °C 冰箱中。

试剂盒内容与存储

Flex Conjugation Kit 组件

组件 / 数量 / −20 °C

Flex Linker 1:数量 100 µg;−20 °C ✓

Flex Linker 2:数量 100 µg;−20 °C ✓

Flex Modifier:数量 100 µL;−20 °C ✓

Flex Quencher:数量 100 µL;−20 °C ✓

其他试剂的存储条件请参考对应的 Leprechaun Kit 说明。

Luni Washer 组件（单独销售）

Solution A (10X) / 100 mL / 4–8 °C

Solution B (10X):100 mL 100 mL;4–8 °C 4–8 °C

Luni Washer 24 Well Plates:100 mL 10;4–8 °C 室温

额外所需设备

—1X DPBS 或 1X PBS（推荐 Gibco DPBS Catalog# 14190144）
—30 kDa MWCO 超滤管（推荐 Amicon Ultra-0.5, EMD Millipore Catalog# UFC503008）。每种抗体需一根独立的超滤管
—台式离心机
—涡旋混合器
—1.5 mL 反应管
—分光光度计（用于测定蛋白浓度）
—去离子水（推荐 Fisher Scientific Catalog# LC267404）或电阻率达 18.2 MΩ·cm 的超纯水
—EMS 风格碳纤维尖头细尖镊子（推荐 Fisher Scientific Catalog# 50-193-0842）

开始前准备

关键参数

—每管 linker（100 µg）偶联一种抗体
—缓冲液交换前最少需要 50 µg 抗体
—交换后可偶联的抗体最佳范围：40–100 µg
—偶联效率最佳的最大体积：100 µL
—Luni 的背景扫描放在 Flex Conjugation Protocol 完成之后
—功能化完成的 Flex Luni 可在 4 °C 过夜保存，但需在 24 小时内使用

Solution A 和 B 配制

10X Solution A 和 10X Solution B 随所有 Leprechaun kit 提供，使用前需稀释 10 倍。

—1X Solution A：将 30 mL Solution A (10X) 与 270 mL 去离子水混合在 500 mL 无菌瓶中。储存在 4 °C
—1X Solution B：将 15 mL Solution B (10X) 与 135 mL 去离子水混合在 250 mL 无菌瓶中。储存在 4 °C

抗体缓冲液兼容性

开始前请确认抗体缓冲液的成分符合以下要求：

缓冲液成分:要求

pH:6.5–8.5

无胺缓冲液 Amine-free buffer:✓

非缓冲盐 Non-buffering salts:✓

螯合剂 Chelating agents:✓

糖类 Sugars:✓

甘油 Glycerol:≤25%

硫柳汞 Thiomersal/Thimerosal:✗

硫柳汞酸钠 Merthiolate:✗

叠氮钠 Sodium-azide:≤0.1%

BSA:✗

明胶 Gelatin:✗

甘氨酸 Glycine:✗

Tris:≤50 mM

ProClin300:≤0.01%

硼酸缓冲液 Borate buffer:✓

亲核组分 Nucleophilic components:✗

推荐偶联前对所有抗体做缓冲液交换；只含 PBS 和 0.1% 叠氮钠的缓冲液不会明显干扰偶联。

Section 1：缓冲液交换与抗体浓缩

1.1 用分光光度计测定抗体的起始浓度（IgG 在 280 nm 的消光系数为 210,000 M⁻¹cm⁻¹）。 - —推荐将抗体浓缩至终浓度 0.5 mg/mL（溶于 1X DPBS 或 1X PBS）
1.2 用微型离心机短暂离心抗体 5 秒，再取至少 50 µg 抗体加入 30 kDa MWCO 超滤管，用 1X DPBS 补至 500 µL。
1.3 9500 × g 离心 4 分钟，19 °C（或室温）。
1.4 取出超滤管，弃去滤液。加入 400 µL 1X DPBS，9500 × g 离心 4 分钟，19 °C（或室温）。
1.5 弃去滤液，加入 400 µL 1X DPBS，9500 × g 离心 8 分钟，19 °C（或室温）。此时体积应约为 50 µL。
1.6 将超滤管反转放入新的收集管中，收集浓缩后的抗体。
1.7 350 × g 离心 2 分钟，19 °C（或室温）。
1.8 目视确认抗体回收，丢弃超滤管。涡旋 3 秒，微型离心机短暂离心 5 秒。
1.9 再次用分光光度计测定浓缩后抗体的浓度： - —用 DPBS 做空白。在 A280 nm 处测定浓缩抗体，使用抗体对应 Ig 亚型的消光系数
1.10 用 DPBS 调整体积，使终浓度为 0.5 mg/mL。

浓度计算示例：

IgG 消光系数（280 nm）：210,000 M⁻¹cm⁻¹

分光光度计读数（IgG 设置）：2 mg/mL

回收抗体体积：40 µL

需加入的 DPBS 体积 = [(测得浓度 × 回收体积) / 目标浓度] − 回收体积

= [(2 mg/mL × 40 µL) / 0.5 mg/mL] − 40 µL = 120 µL

Section 2：抗体-linker 偶联

Flex Linker 1 和 Linker 2 的偶联流程相同。

使用 Lentivirus Flex RNA 和 Lentivirus Flex EV Contaminant Kit 时：Flex Linker 1 必须偶联自定义包膜抗体；Flex Linker 2 偶联对应的同型对照抗体。

2.1 取出一管 Flex Linker、Flex Modifier 和 Flex Quencher，室温平衡 10–15 分钟。
2.2 标记一根新反应管"Antibody + Modifier"。涡旋 Flex Modifier 3–5 秒。
2.3 取 80 µL 浓缩后的抗体转移至新管中，加入 8 µL Flex Modifier（绿色盖子）。上下吹打 4–5 次轻柔混匀。
2.4 将 80 µL 上述混合物加入 linker 管中。上下吹打混匀。此步骤启动偶联反应：linker 被重悬并开始偶联。室温静置 45 分钟，不要振摇。
2.5 加入 8 µL Flex Quencher（红色盖子）终止反应，室温静置 15 分钟。
2.6 将抗体-linker 偶联物转移至新管中，4 °C 保存。

本试剂盒无需额外的纯化步骤。

未使用的试剂盒组件保存在 −20 °C（参考试剂盒内容与存储部分）。

Section 3：抗体-linker 偶联物在 Flex Luni 上的孵育

每个 Luni 需要 35 µL 稀释后的偶联物，按使用的 Luni 数量算出总体积。

3.1 将抗体-linker 偶联物用 1X Solution A 稀释 1:100（即取 1 µL 偶联物加入 99 µL 1X Solution A）。

Linker 1 和 Linker 2 的偶联物可以同时使用。将两者混合加入 1X Solution A，按 1:100 稀释，即 1 µL Linker 1 偶联物 + 1 µL Linker 2 偶联物 + 98 µL 1X Solution A。

3.2 将 Luni 放入 Luni Washer 24 孔板的指定孔位，Luni ID 朝向干燥斜台（ramp）。
3.3 向每个 Luni 上加入 35 µL 稀释后的偶联物，室温静置 30 分钟，不要振摇。
3.4 孵育完成后，将 24 孔板放入 Luni Washer，确保 A1 孔位于左上角，合上盖子。在触摸屏上选择 Flex Prep。
3.5 按 First Strip，输入含有 Luni 的第一行编号。
3.6 按 Number of Strips，输入含有 Luni 的总行数。
3.7 按 Start。
3.8 提示将 Luni 移至干燥斜台时，转到 Section 4 操作。

Section 4：Luni 干燥

4.1 提示时将 Luni 移至干燥斜台。移动过程中，Luni 要始终浸没在液面下。按 Continue。
4.2 程序完成后，取出 Luni 放在吸水垫上，Luni ID 朝上。完全干燥后方可使用。

至此，Flex Luni 已用所选抗体完成功能化。

功能化后的 Luni 必须先进行背景扫描，再进行样品孵育。

section-1 · 缓冲液交换与浓缩
section-2 · 抗体-linker 偶联